Wiki FKKT - User contributions [en]

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-12T20:41:16Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita lakota==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirnata ekspresijska platforma za diagnostiko==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so liofilizirali na papirnatih diskih [4].

Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4]. Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom liofilizacije, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve v odsotnosti teofilina [4].

==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

==Zaključek==
V okviru projekta AptaVita je skupina razvila potencialen sistem za diagnostiko pomanjkanja vitaminov. Njihov produkt predstavlja alternativo dragim metodam in bi tako lahko pripomogel k zmanjševanju skrite lakote v državah z nizkimi dohodki. Potrebno bi bilo narediti še veliko izboljšav, na primer integracijo odkritih biosenzorjev v genetsko vezje in določitev boljšega načina shranjevanja komponenet kot liofilizacija.

==Viri==
1. Micronutrients https://www.who.int/health-topics/micronutrients#tab=tab_1 (pridobljeno 10. 4. 2022).

2. Micronutrient Deficiency - Our World in Data https://ourworldindata.org/micronutrient-deficiency#licence (pridobljeno 9. 4. 2022).

3. N. M. Lowe: The global challenge of hidden hunger: Perspectives from the field. In: Proceedings of the Nutrition Society. Cambridge University Press 2021, Vol. 80, pp. 283–289.

4. Team:TUDelft - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 9. 4. 2022).

5. B. Townshend, J. S. Xiang, G. Manzanarez, E. J. Hayden, C. D. Smolke: A multiplexed, automated evolution pipeline enables scalable discovery and characterization of biosensors. Nat. Commun. 2021, 12(1).

6. A. Doerr, E. De Reus, P. Van Nies, M. Van Der Haar, K. Wei, J. Kattan, A. Wahl, C. Danelon: Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys. Biol. 2019, 16(2).

7. Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda: Cell-Free Translation Reconstituted with Purified Components. , 2001.

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-12T19:31:12Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita lakota==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirnata ekspresijska platforma za diagnostiko==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so liofilizirali na papirnatih diskih [4].

Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4]. Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom liofilizacije, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve v odsotnosti teofilina [4].

==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

==Zaključek==
V okviru prijekta AptaVita je skupina razvila potencialen sistem za diagnostiko pomanjkanja vitaminov. Njihov produkt predstavlja alternativo dragim metodam in bi tako lahko pripomogel k zmanjševanju skrite lakote v državah z nizkimi dohodki. Potrebno bi bilo narediti še veliko izboljšav, na primer integracijo odkritih biosenzorjev v genetsko vezje in določitev boljšega načina shranjevanja komponenet kot liofilizacija.

==Viri==
1. Micronutrients https://www.who.int/health-topics/micronutrients#tab=tab_1 (pridobljeno 10. 4. 2022).

2. Micronutrient Deficiency - Our World in Data https://ourworldindata.org/micronutrient-deficiency#licence (pridobljeno 9. 4. 2022).

3. N. M. Lowe: The global challenge of hidden hunger: Perspectives from the field. In: Proceedings of the Nutrition Society. Cambridge University Press 2021, Vol. 80, pp. 283–289.

4. Team:TUDelft - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 9. 4. 2022).

5. B. Townshend, J. S. Xiang, G. Manzanarez, E. J. Hayden, C. D. Smolke: A multiplexed, automated evolution pipeline enables scalable discovery and characterization of biosensors. Nat. Commun. 2021, 12(1).

6. A. Doerr, E. De Reus, P. Van Nies, M. Van Der Haar, K. Wei, J. Kattan, A. Wahl, C. Danelon: Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys. Biol. 2019, 16(2).

7. Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda: Cell-Free Translation Reconstituted with Purified Components. , 2001.

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-12T19:30:13Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita lakota==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirnata ekspresijska platforma za diagnostiko==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so liofilizirali na papirnatih diskih [4].

Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4]. Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom liofilizacije, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve v odsotnosti teofilina [4].

==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

==Zaključek==
V okviru prijekta AptaVita je skupina razvila potencialen sistem za diagnostiko pomanjkanja vitaminov. Njihov produkt predstavlja alternativo dragim metodam in bi tako lahko pripomogel k zmanjševanju skrite lakote v državah z nizkimi dohodki. Potrebno bi bilo narediti še veliko izboljšav, na primer integracija odkritih biosenzorjev v genetsko vezje in določitev boljšega načina skranjevanja komponenet kot liofilizacija.

==Viri==
1. Micronutrients https://www.who.int/health-topics/micronutrients#tab=tab_1 (pridobljeno 10. 4. 2022).

2. Micronutrient Deficiency - Our World in Data https://ourworldindata.org/micronutrient-deficiency#licence (pridobljeno 9. 4. 2022).

3. N. M. Lowe: The global challenge of hidden hunger: Perspectives from the field. In: Proceedings of the Nutrition Society. Cambridge University Press 2021, Vol. 80, pp. 283–289.

4. Team:TUDelft - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 9. 4. 2022).

5. B. Townshend, J. S. Xiang, G. Manzanarez, E. J. Hayden, C. D. Smolke: A multiplexed, automated evolution pipeline enables scalable discovery and characterization of biosensors. Nat. Commun. 2021, 12(1).

6. A. Doerr, E. De Reus, P. Van Nies, M. Van Der Haar, K. Wei, J. Kattan, A. Wahl, C. Danelon: Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys. Biol. 2019, 16(2).

7. Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda: Cell-Free Translation Reconstituted with Purified Components. , 2001.

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T22:00:13Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita lakota==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirnata ekspresijska platforma za diagnostiko==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so liofilizirali na papirnatih diskih [4].

Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4]. Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom liofilizacije, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve v odsotnosti teofilina [4].

==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

==Zaključek==
V okviru prijekta AptaVita je skupina razvila potencialen sistem za diagnostiko pomanjkanja vitaminov. Njihov produkt predstavlja alternativo dragim metodam in bi tako lahko pripomoral k zmanjševanju skrite lakote v državah z nizkimi dohodki. Potrebno bi bilo narediti še veliko izboljšav, na primer integracija odkritih biosenzorjev v genetsko vezje in določitev boljšega načina skranjevanja komponenet kot liofilizacija.

==Viri==
1. Micronutrients https://www.who.int/health-topics/micronutrients#tab=tab_1 (pridobljeno 10. 4. 2022).

2. Micronutrient Deficiency - Our World in Data https://ourworldindata.org/micronutrient-deficiency#licence (pridobljeno 9. 4. 2022).

3. N. M. Lowe: The global challenge of hidden hunger: Perspectives from the field. In: Proceedings of the Nutrition Society. Cambridge University Press 2021, Vol. 80, pp. 283–289.

4. Team:TUDelft - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 9. 4. 2022).

5. B. Townshend, J. S. Xiang, G. Manzanarez, E. J. Hayden, C. D. Smolke: A multiplexed, automated evolution pipeline enables scalable discovery and characterization of biosensors. Nat. Commun. 2021, 12(1).

6. A. Doerr, E. De Reus, P. Van Nies, M. Van Der Haar, K. Wei, J. Kattan, A. Wahl, C. Danelon: Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys. Biol. 2019, 16(2).

7. Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda: Cell-Free Translation Reconstituted with Purified Components. , 2001.

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T21:51:45Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita lakota==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirnata ekspresijska platforma za diagnostiko==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so liofilizirali na papirnatih diskih [4].

Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4]. Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom liofilizacije, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve v odsotnosti teofilina [4].

==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

==Viri==
1. Micronutrients https://www.who.int/health-topics/micronutrients#tab=tab_1 (pridobljeno 10. 4. 2022).

2. Micronutrient Deficiency - Our World in Data https://ourworldindata.org/micronutrient-deficiency#licence (pridobljeno 9. 4. 2022).

3. N. M. Lowe: The global challenge of hidden hunger: Perspectives from the field. In: Proceedings of the Nutrition Society. Cambridge University Press 2021, Vol. 80, pp. 283–289.

4. Team:TUDelft - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 9. 4. 2022).

5. B. Townshend, J. S. Xiang, G. Manzanarez, E. J. Hayden, C. D. Smolke: A multiplexed, automated evolution pipeline enables scalable discovery and characterization of biosensors. Nat. Commun. 2021, 12(1).

6. A. Doerr, E. De Reus, P. Van Nies, M. Van Der Haar, K. Wei, J. Kattan, A. Wahl, C. Danelon: Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys. Biol. 2019, 16(2).

7. Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda: Cell-Free Translation Reconstituted with Purified Components. , 2001.

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T21:51:30Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirnata ekspresijska platforma za diagnostiko==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so liofilizirali na papirnatih diskih [4].

Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4]. Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom liofilizacije, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve v odsotnosti teofilina [4].

==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

==Viri==
1. Micronutrients https://www.who.int/health-topics/micronutrients#tab=tab_1 (pridobljeno 10. 4. 2022).

2. Micronutrient Deficiency - Our World in Data https://ourworldindata.org/micronutrient-deficiency#licence (pridobljeno 9. 4. 2022).

3. N. M. Lowe: The global challenge of hidden hunger: Perspectives from the field. In: Proceedings of the Nutrition Society. Cambridge University Press 2021, Vol. 80, pp. 283–289.

4. Team:TUDelft - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 9. 4. 2022).

5. B. Townshend, J. S. Xiang, G. Manzanarez, E. J. Hayden, C. D. Smolke: A multiplexed, automated evolution pipeline enables scalable discovery and characterization of biosensors. Nat. Commun. 2021, 12(1).

6. A. Doerr, E. De Reus, P. Van Nies, M. Van Der Haar, K. Wei, J. Kattan, A. Wahl, C. Danelon: Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys. Biol. 2019, 16(2).

7. Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda: Cell-Free Translation Reconstituted with Purified Components. , 2001.

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T21:48:21Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirnata ekspresijska platforma za diagnostiko==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so liofilizirali na papirnatih diskih [4].

Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4]. Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom liofilizacije, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve v odsotnosti teofilina [4].

==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T21:42:50Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T21:37:40Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

• T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

• reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

• 3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

• T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T21:26:27Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4].

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7 promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7 terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T21:21:24Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 10^12 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7 promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7 terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T21:20:27Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 1012 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7 promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7 terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T20:59:38Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: SKRITA LAKOTA==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje pa je ključnega pomena in pomanjkanje katerega koli od mikrohranil lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki vpliva povzroča slabi telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupine ljudi [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki. To je skupino navdihnilo, da je razvila hitri diagnostični test, ki bi bil sposoben diagnosticirati pomanjkanje mikrohranil v regijah z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: APTAVITA==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnosticiranje pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirni podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno strojno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov, saj vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo de novo hitrega in vitro razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].
Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone na 5'-koncu iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih so tarčni ligandi odsotni, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo ciljni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo NGS v knjižnicah identificirajo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 1012 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7 promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7 terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T20:55:04Z

Valeriya Musina:

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov.

==Problem: SKRITA LAKOTA==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje pa je ključnega pomena in pomanjkanje katerega koli od mikrohranil lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki vpliva povzroča slabi telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupine ljudi [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki. To je skupino navdihnilo, da je razvila hitri diagnostični test, ki bi bil sposoben diagnosticirati pomanjkanje mikrohranil v regijah z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: APTAVITA==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnosticiranje pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirni podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno strojno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov, saj vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo de novo hitrega in vitro razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].
Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone na 5'-koncu iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih so tarčni ligandi odsotni, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo ciljni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo NGS v knjižnicah identificirajo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 1012 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7 promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7 terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T20:35:07Z

Valeriya Musina:

==Problem: SKRITA LAKOTA==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje pa je ključnega pomena in pomanjkanje katerega koli od mikrohranil lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki vpliva povzroča slabi telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupine ljudi [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki. To je skupino navdihnilo, da je razvila hitri diagnostični test, ki bi bil sposoben diagnosticirati pomanjkanje mikrohranil v regijah z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: APTAVITA==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnosticiranje pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirni podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno strojno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov, saj vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo de novo hitrega in vitro razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].
Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone na 5'-koncu iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih so tarčni ligandi odsotni, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo ciljni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo NGS v knjižnicah identificirajo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 1012 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7 promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7 terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T20:26:04Z

Valeriya Musina:

==Problem: SKRITA LAKOTA==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje pa je ključnega pomena in pomanjkanje katerega koli od mikrohranil lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki vpliva povzroča slabi telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupine ljudi [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki. To je skupino navdihnilo, da je razvila hitri diagnostični test, ki bi bil sposoben diagnosticirati pomanjkanje mikrohranil v regijah z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: APTAVITA==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnosticiranje pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirni podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno strojno opremo [4].

==APTACIMI==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov, saj vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo de novo hitrega in vitro razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].
Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone na 5'-koncu iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih so tarčni ligandi odsotni, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo ciljni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo NGS v knjižnicah identificirajo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 1012 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7 promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7 terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T17:27:57Z

Valeriya Musina:

==Problem: SKRITA LAKOTA==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje pa je ključnega pomena in pomanjkanje katerega koli od mikrohranil lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki vpliva povzroča slabi telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupine ljudi [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki. To je skupino navdihnilo, da je razvila hitri diagnostični test, ki bi bil sposoben diagnosticirati pomanjkanje mikrohranil v regijah z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: APTAVITA==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnosticiranje pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirni podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno strojno opremo [4].

==APTACIMI==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov, saj vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo de novo hitrega in vitro razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].
Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone na 5'-koncu iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih so tarčni ligandi odsotni, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo ciljni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo NGS v knjižnicah identificirajo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 1012 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7-promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7-terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirna osnova==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].
==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T17:26:00Z

Valeriya Musina:

==Problem: SKRITA LAKOTA==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje pa je ključnega pomena in pomanjkanje katerega koli od mikrohranil lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki vpliva povzroča slabi telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupine ljudi [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki. To je skupino navdihnilo, da je razvila hitri diagnostični test, ki bi bil sposoben diagnosticirati pomanjkanje mikrohranil v regijah z nizkimi dohodki [4].

Ideja: APTAVITA
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnosticiranje pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirni podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno strojno opremo [4].

APTACIMI
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov, saj vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

DRIVER
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo de novo hitrega in vitro razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].
Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone na 5'-koncu iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih so tarčni ligandi odsotni, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo ciljni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo NGS v knjižnicah identificirajo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
Izvedba
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 1012 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

Genetsko vezje
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7-promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7-terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

Liofilizirana brezcelična papirna osnova
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].

Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

2022-04-11T17:24:02Z

Valeriya Musina: New page: ="Problem: SKRITA LAKOTA"= Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje pa je ključnega pomena in pomanjkanje katerega ko...

="Problem: SKRITA LAKOTA"=
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje pa je ključnega pomena in pomanjkanje katerega koli od mikrohranil lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki vpliva povzroča slabi telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupine ljudi [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki. To je skupino navdihnilo, da je razvila hitri diagnostični test, ki bi bil sposoben diagnosticirati pomanjkanje mikrohranil v regijah z nizkimi dohodki [4].

Ideja: APTAVITA
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnosticiranje pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirni podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno strojno opremo [4].

APTACIMI
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov, saj vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].

DRIVER
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo de novo hitrega in vitro razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4].
Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone na 5'-koncu iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih so tarčni ligandi odsotni, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo ciljni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo NGS v knjižnicah identificirajo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5].
Izvedba
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic z 1012 potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja z veliko zanko dolgo 60 nukleotidov (N60) [4].
Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo na mešanico vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].
V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4].
Od vseh kandidatov so kot potencialna aptacima izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4].

Genetsko vezje
Zasnovali so genetsko vezje, kjer je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen lacZ, ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4].
Pripravljeno genetsko vezje (BBa_K3806014) je bilo sestavljeno iz:
• T7-promotorja (BBa_K3633015)
• cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806010)
• Reporterskega gena lacZ z optimizirano rabo kodona za E.coli (BBa_K3806012)
• 3' UTR (BBa_K3806013)
• T7-terminatorja (BBa_K395601).
Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo [4].
Da bi izboljšali izražanje so zasnovali nov konstrukt (BBa_K3806016), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšano izražanje v primerjavi z odsotnostjo teofilina. Dodatek 5 mM teofilina po 1,5 urah izražanja povzroči 33,3% zmanjšanje izražanja semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

Liofilizirana brezcelična papirna osnova
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so posušili z zamrzovanjem na papirnatih diskih [4].
Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve papirne plošče. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4].
Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom sušenja z zamrzovanjem, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve za pogoje brez teofilina [4].

Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

Seminarji SB 2021/22

2022-04-11T17:18:51Z

Valeriya Musina:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
Lanski primer:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-08T18:57:38Z

Valeriya Musina:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic,) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-11-09T21:49:28Z

Valeriya Musina: /* Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procesov */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-11-09T21:45:57Z

Valeriya Musina: /* Valeriya Musina: Vloga intermediatov Krebsovega cikla pri preoblikovanju celičnih procesov */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procesov===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

BIO2 Seminar 2018

2018-11-09T21:44:41Z

Valeriya Musina:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Vpliv cistationin γ-liaze in ATF4 pri Huntingtonovi bolezni|| Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Fotorespiracija in načini izboljšanja fotosinteze || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-11-09T21:38:51Z

Valeriya Musina: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Valeriya_Musina:_Vloga_intermediatov_Krebsovega_cikla_pri_preoblikovanju_celi.C4.8Dnih_procesov] || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Vpliv cistationin γ-liaze in ATF4 pri Huntingtonovi bolezni|| Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Fotorespiracija in načini izboljšanja fotosinteze || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-11-09T21:35:33Z

Valeriya Musina:

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vloga intermediatov Krebsovega cikla pri preoblikovanju celičnih procesov===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-02-26T21:43:10Z

Valeriya Musina: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

TBK2018-seminar

2018-02-26T21:36:42Z

Valeriya Musina: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220183954.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić ||Toksin botulin "preskočil" v novo vrsto bakterije ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180126122856.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-02-23T18:47:30Z

Valeriya Musina: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Bakrov(II) fenantrolin metalopeptid tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu || https://vector.childrenshospital.org/2017/08/runaway-train-autoimmune-diseases/ || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj || || || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić ||Toksin botulin "preskočil" v novo vrsto bakterije ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180126122856.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-02-23T18:43:11Z

Valeriya Musina: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Bakrov(II)-fenantrolin metalopeptid tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu || https://vector.childrenshospital.org/2017/08/runaway-train-autoimmune-diseases/ || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj || || || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić ||Toksin botulin "preskočil" v novo vrsto bakterije ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180126122856.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-02-23T09:10:00Z

Valeriya Musina: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || naslov || link || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Bakrov(II)-fenantrolin metalipeptid tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || || || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj || || || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-02-23T09:07:45Z

Valeriya Musina: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Bakrov(II)-fenantrolin metalipeptid tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || naslov || link || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || || || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj || || || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || || || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || || || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.