Wiki FKKT - User contributions [en]

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-05T14:05:43Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge, za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo, se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7(9) (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> Weber, E. ''et al''. "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs". PLoS ONE (San Francisco) Vol. 6(2) (2011): e16765 </ref>.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2 <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne <ref name="prvi"> </ref>.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu <ref name="prvi"> </ref>.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši <ref name="prvi"> </ref>.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost ''psbD'' mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina <ref name="prvi"> </ref>.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina. To nakazuje na efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4'' <ref name="prvi"> </ref>.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'' torej omogoča ekspresijo gena ''ble-GFP'' in pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4 <ref name="prvi"> </ref>.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčnem kompartmentu <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-05T13:57:43Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge, za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo, se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7(9) (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> Weber, E. ''et al''. "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs". PLoS ONE (San Francisco) Vol. 6(2) (2011): e16765 </ref>.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2 <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne <ref name="prvi"> </ref>.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu <ref name="prvi"> </ref>.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši <ref name="prvi"> </ref>.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost ''psbD'' mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina <ref name="prvi"> </ref>.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina. To nakazuje na efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4'' <ref name="prvi"> </ref>.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'' torej omogoča ekspresijo gena ''ble-GFP'' in pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4 <ref name="prvi"> </ref>.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-05T13:43:37Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge, za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo, se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7(9) (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> Weber, E. ''et al''. "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs". PLoS ONE (San Francisco) Vol. 6(2) (2011): e16765 </ref>.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2 <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne <ref name="prvi"> </ref>.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu <ref name="prvi"> </ref>.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši <ref name="prvi"> </ref>.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost ''psbD'' mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina <ref name="prvi"> </ref>.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina <ref name="prvi"> </ref>.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4'' <ref name="prvi"> </ref>.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-05T12:26:07Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge, za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo, se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7(9) (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> Weber, E. ''et al''. "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs". PLoS ONE (San Francisco) Vol. 6(2) (2011): e16765 </ref>.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2 <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne <ref name="prvi"> </ref>.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu <ref name="prvi"> </ref>.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši <ref name="prvi"> </ref>.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina <ref name="prvi"> </ref>.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina <ref name="prvi"> </ref>.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4'' <ref name="prvi"> </ref>.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T18:15:48Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7(9) (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> Weber, E. ''et al''. "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs". PLoS ONE (San Francisco) Vol. 6(2) (2011): e16765 </ref>.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2 <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne <ref name="prvi"> </ref>.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu <ref name="prvi"> </ref>.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši <ref name="prvi"> </ref>.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina <ref name="prvi"> </ref>.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina <ref name="prvi"> </ref>.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4'' <ref name="prvi"> </ref>.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu <ref name="prvi"> </ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T17:57:57Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7(9) (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> Weber, E. ''et al''. "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs". PLoS ONE (San Francisco) Vol. 6(2) (2011): e16765 </ref>.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2 <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne <ref name="prvi"> </ref>.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu <ref name="prvi> </ref>.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši <ref name="prvi"> </ref>.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4''.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas''.

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T17:53:47Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7(9) (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas'' <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> Weber, E. ''et al''. "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs". PLoS ONE (San Francisco) Vol. 6(2) (2011): e16765 </ref>.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2 <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne <ref name="prvi"> </ref>.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu <ref name="prvi> </ref>.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši <ref name="prvi"> </ref>.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4''.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas''.

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu.

<h2>Viri</h2>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T17:36:01Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7,9 (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas''.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4''.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas''.

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu.

<h2>Viri</h2>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T17:34:18Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. ''et al''. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7,9 (2018): 2074-2086 </ref>

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas''.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4''.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas''.

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu.

<h2>Viri</h2>

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T17:22:51Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas''.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4''.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas''.

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu.

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T17:22:19Z

Veronika Razpotnik:

Izhodiščni članek [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00251 Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''. ASC Synthetic Biology, 2018]

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas''.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4''.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas''.

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu.

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T16:33:40Z

Veronika Razpotnik:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 Andrej Race 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T16:32:04Z

Veronika Razpotnik:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_''C._reinhardtii'' Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 Andrej Race 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T16:25:19Z

Veronika Razpotnik:

<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas''.

<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo</h2>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji PPSAD in PβTUB2 z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz ''Gaussie princeps'' (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (PAR in TRBC52) za močno konstitutivno izražanje v ''Chlamydomonas''. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (PAR in PPSAD) in terminatorjev (TRBCS2 in TPSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom ''Chlamydomonas''. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je TPSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja.

<h2>Kontrola izražanja genov</h2>
Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja PNIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer PNIT1 kontrolira ekspresijo gena ''ble-GFP'' je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor PPSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor PMETE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta ''nac2-26'', ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu ''nac2-26'', modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja PMETE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo ''THI4'' rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina.

Modul, ki združuje PAR in RNA stikalo ''THI4'', da lahko omogoči ekspresijo gena ''ble-GFP'', je omogočil pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4. Rezistenca se je pojavila v prisotnosti tiamina ali HET, ne pa tudi HMP, kar je pokazalo efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala ''THI4''.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu ''MAA7'', katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo PPSAD in TPSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila ''MAA7'', vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena ''MAA7'' najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani PNIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v ''Chlamydomonas''.

<h2>Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov</h2>
Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto ''rap2'', neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina.

<h2>Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah</h2>
Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za ''Chlamydomonas'' vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčenem kompartmentu.

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T16:07:54Z

Veronika Razpotnik:

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T16:01:25Z

Veronika Razpotnik:

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T15:52:04Z

Veronika Razpotnik:

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T15:51:37Z

Veronika Razpotnik:

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T15:51:14Z

Veronika Razpotnik:

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T15:50:19Z

Veronika Razpotnik:

Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T15:41:45Z

Veronika Razpotnik: New page: <h2>Uvod</h2> Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bo...

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T15:38:20Z

Veronika Razpotnik:

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T15:37:06Z

Veronika Razpotnik:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_biološki_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 Andrej Race 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T15:36:38Z

Veronika Razpotnik:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_biološki_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhadtii''] (Veronika Razpotnik) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 Andrej Race 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T15:34:44Z

Veronika Razpotnik:

Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T15:28:32Z

Veronika Razpotnik:

Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

2020-04-03T15:25:51Z

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T15:18:47Z

Veronika Razpotnik:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_biološki_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhadtii] (Veronika Razpotnik) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 Andrej Race 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T15:18:12Z

Veronika Razpotnik:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_biološki sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhadtii] (Veronika Razpotnik) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 Andrej Race 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T15:17:00Z

Veronika Razpotnik:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_biološki sistem_MoClo_za_biološko sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhadtii] (Veronika Razpotnik) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 Andrej Race 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-03T15:15:19Z

Veronika Razpotnik:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_biološki sistem_MoClo_za_biološko sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhadtii] Veronika Razpotnik 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 Andrej Race 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-03-04T19:02:22Z

Veronika Razpotnik:

Seminarji SB 2019/20

2020-03-04T19:01:44Z

Veronika Razpotnik:

Seminarji SB 2019/20

2020-03-04T19:00:52Z

Veronika Razpotnik:

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-14T13:07:25Z

Veronika Razpotnik: /* Okužbeni cikel */

==Uvod==
Herpesvirusi so velika družina virusov, ki imajo dvojnovijačno DNA. Ostali predstavniki takšnih virusov so adenovirus, poksivirusi, papilomavirus in vacinia virus. Poznamo osem vrst herpesvirusov, ki jih delimo v tri poddružine, in sicer α, β in γ. Herpesvirusi α se nahajajo v živčnih ganglijih gostitelja. Zanje je značilno hitro podvojevanje. Herpesvirusi β povzročajo močno povečanje okužene celice, herpesvirusi γ pa pogosto povezujemo z nastankom raka. V seminarski nalogi se bomo osredotočili na hespesvirus simpleks 1.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki lahko poteka na dva načina. Prva možnost je, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano in ostane njen sestavni del, proteinske komponenete pa v citoplazmo vstopijo ločeno od virusne DNA. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže najprej na proteoglikan heparan sulfat, nato pa še na celični membranski receptor. V fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Zatem virus sprosti svojo DNA v citosol skozi fuzijsko poro.
Druga možnost je fagocitoza. Glikoproteini se enako kot prej najprej povežejo s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu in nato z receptorji. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo celoten virusni delec.

V jedro potuje virus oz. njegovi sestavni deli v obeh primerih vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in DNA vstopi v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Replikacija==
===Genom===
Genom herpesvirusa je velik, kompleksen in krožen. Sestavljen je iz dveh regij UL in US. Vsebuje tri mesta replikacije, in sicer oriL in oriS, ki se pojavi v dveh kopijah. Obe mesti replikacije vsebujeta z adenozini in timini bogato regijo, v bližini katere je veliko prepoznavnih mest za ori-vezavne proteine.
Genom kodira sedem proteinov, ki so esencialni za replikacijo. UL9 kodira za protein, ki veže proteine na mesto ori, poleg tega pa ima tudi helikazno funkcijo. UL30 kodira za katalitično podenoto DNA polimeraze, UL42 pa za procesivno enoto. UL5, UL8 in UL52 kodirajo za protein, ki je podenota helikaznega-primaznega kompleksa (H/P kompleks), vsak pa ima drugačno funkcijo. UL5 vsebuje helikazni, UL52 pa primazni motiv. Funkcija UL8 je ta, da interagira z drugimi proteini. Poleg teh je zelo pomemben še gen UL29 (ICP8), ki kodira za ssDNA-vezavne proteine.

===Mehanizem replikacije===
Proces replikacije se začne na enem od mest ori, ki vsebuje UL9 in ICP8. UL9 in ICP8 delujeta tako, da popačita z adenini in timini bogato regijo in destabilizirata mesto ori. To se zgodi tako, da se dva UL9 dimera vežeta na škatli I in II ter skupaj z ICP8, v prisotnosti ATP, inducirajo formacijo lasnice. Pri tem pride do konformacijskih sprememb v UL9, kar povzroči, da izgubi afiniteto do vezave na mesto ori. Izpostaljena ssDNA povzroči konformacijske spremembe v ICP8, ki se nato sprosti z UL9 in se veže na ssDNA in prepreči, da bi se veriga ponovno povezala z drugo.
Kompleks H/P odvije dvoverižno DNA in sintetizira začetni oligonukleotid, a le v primeru, ko ima na voljo vsaj šest nukleotidov dolgo enoverižno verigo. Za vezavo polimeraze na DNA so potrebne konformacijske spremembe v kompleksu H/P in RNA primerju. Ko se polimeraza pritrdi na replikacijske vilice, se začne sinteza vodilne in zastajajoče verige. Ko se replikacijski vilici srečata, iniciatorski protein prereže eno od verig. Nerezana veriga služi kot matrica za replikacijo rezane verige. Pri tem nastane konkatemerna DNA, ki se nato cepi in zapakira.
==Iniciacija transkripcije==
Pri virusu Herpes Simpleks tipa 1 (HSV-1) je znotraj linearnega virusnega genoma, ki je dolg 152 kbp, kodiranih približno 80 genov. Geni se izražajo v treh zaporednih fazah in se prepisujejo s pomočjo celične RNA polimeraze II. Vsi virusni promotorji imajo značilno nukleotidno zaporedje imenovano TATA škatla, ki se nahaja 25 nukleotidov navzgor od začetnega mesta transkripcije. Genom HSV-1 je sestavljen iz treh skupin genov: takojšnji zgodnji, zgodnji in pozni geni.

===Mehanizem===
Prvih pet genov, ki jih je treba pri okužbi prepisati, so takojšnji zgodnji geni, ki se v nukleotidnem zaporedju razlikujejo od zgodnjih in poznih genov. Imajo posebno zaporedje TAATGARA, ki se nahaja navzgor od promotorja. Za začetek izražanja je potreben transkripcijski faktor, ki po vezavi na promotor sproži prepisovanje gena. Vezavno mesto na nukleotidni verigi prepozna protein iz virusnega tegumenta, imenovan protein VP16. Vezava VP16 na molekulo DNA ni možna, če niso prisotni dodatni proteini, ki tvorijo kompleks in na ta način vezavo stabilizirajo ter sprožijo prepisovanje gena. Kompleks tvorijo protein VP16 in dva dodatna proteina gostiteljske celice, HCF in Oct-1. HCF stabilizira vezavo na nukleotidnem zaporedju, dokler Oct-1 ne aktivira RNA polimeraze II. RNA polimeraza II začne prepisovati nukleotidno zaporedje v mRNA. Po sintezi mRNA sledi zorenje mRNA in njen prenos do citosolnih celičnih ribosomov, kjer pride do translacije kodona in sinteze α proteinov. Enako kot pri takojšnjih zgodnjih genih tudi zgodnji in pozni geni potrebujejo virusno kodirani transkripcijski faktor, ki iniciira začetek transkripcije. Ta se imenuje ICP4 in eden od proteinov α. Zapisan je na takojšnjih zgodnjih genih. ICP4 je jedrni fosfoprotein, ki deluje kot homodimer za aktivacijo ali utišanje transkripcije, odvisno od promotorja, na katerega se veže. ICP4 je nujno potreben za izražanje zgodnjih in poznih genov. V odsotnosti transkripcijskega faktorja ICP4 so zgodnji geni slabo izraženi, takojšnji zgodnji geni pa so prekomerno izraženi. Prekomerno izražanje teh genov povzroči, da ICP4 prepreči transkripcijo svojega lastnega promotorja in nekaterih drugih promotorjev na takojšnjih zgodnjih genih. Vezava ICP4 na promotorske regije zgodnjih in poznih genov je bistvena za začetek transkripcije samega gena. ICP4 tvori trimer v območju TATA škatle. V trimeru se poveže s TBP in TFIIB. Ta povezava stabilizira vezavo TAF250 na DNA in tako aktivira RNA polimerazo II, ki začne transkripcijo genov. Sintetizirani mRNA sledi zorenje in prenos do citosolnih ribosomov. V tej skupini genov na ribosomih poteka translacija proteinov β, ki so večinoma dejavniki prepisovanja poznih genov ali encimi (UL9, vezavni DNA protein UL29(ICP8), DNA polimeraza, timidinska kinaza). Naslednja faza je transkripcija poznih genov in sinteza strukturnih proteinov na citoplazemskih ribosomih. Tudi pri tej skupini genov je seveda izražanje nadzorovano. Eden izmed glavnih proteinov, ki aktivira transkripcijo poznih genov, je protein ICP4. Drugi protein je ICP8, ki ima pomembno vlogo pri podvojevanju virusne DNA, v tej skupini genov pa transkripcijo zavira. Mehanizem regulacije izražanja poznih genov ni natančno določen, a znano je, da visoka koncntracija prostega proteina IPC8 močno utiša transkripcijo poznih genov in posledično sintezo strukturnih proteinov γ.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato zreli virusi skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra, potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

==Širjenje virusov iz celice v celico==
Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400
*Weller, S. K., Coen, D. M. Herpes Simplex Viruses: Mechanisms of DNA Replication. Cold Spring Habor Perspective in Biology, 2012, 4 (9), str. 1-15
*Kim D., Zabierowski S., DeLuca N. A. The initiator element in a herpes simplex virus type 1 late-gene promoter enhances activation by ICP4, resulting in abundant late gene expression. J. Virol. 2002;76:1548–1558
*Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis - PubMed - NCBI. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21348071. Accessed April 13, 2018.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-14T11:20:19Z

Veronika Razpotnik: /* Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo */

==Uvod==
Herpesvirusi so velika družina virusov, ki imajo dvojnovijačno DNA. Ostali predstavniki takšnih virusov so adenovirus, poksivirusi, papilomavirus in vacinia virus. Poznamo osem vrst herpesvirusov, ki jih delimo v tri poddružine, in sicer α, β in γ. Herpesvirusi α se nahajajo v živčnih ganglijih gostitelja. Zanje je značilno hitro podvojevanje. Herpesvirusi β povzročajo močno povečanje okužene celice, herpesvirusi γ pa pogosto povezujemo z nastankom raka. V seminarski nalogi se bomo osredotočili na hespesvirus simpleks 1.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Replikacija==
===Genom===
Genom herpesvirusa je velik, kompleksen in krožen. Sestavljen je iz dveh regij UL in US. Vsebuje tri mesta replikacije, in sicer oriL in oriS, ki se pojavi v dveh kopijah. Obe mesti replikacije vsebujeta z adenozini in timini bogato regijo, v bližini katere je veliko prepoznavnih mest za ori-vezavne proteine.
Genom kodira sedem proteinov, ki so esencialni za replikacijo. UL9 kodira za protein, ki veže proteine na mesto ori, poleg tega pa ima tudi helikazno funkcijo. UL30 kodira za katalitično podenoto DNA polimeraze, UL42 pa za procesivno enoto. UL5, UL8 in UL52 kodirajo za protein, ki je podenota helikaznega-primaznega kompleksa (H/P kompleks), vsak pa ima drugačno funkcijo. UL5 vsebuje helikazni, UL52 pa primazni motiv. Funkcija UL8 je ta, da interagira z drugimi proteini. Poleg teh je zelo pomemben še gen UL29 (ICP8), ki kodira za ssDNA-vezavne proteine.

===Mehanizem replikacije===
Proces replikacije se začne na enem od mest ori, ki vsebuje UL9 in ICP8. UL9 in ICP8 delujeta tako, da popačita z adenini in timini bogato regijo in destabilizirata mesto ori. To se zgodi tako, da se dva UL9 dimera vežeta na škatli I in II ter skupaj z ICP8, v prisotnosti ATP, inducirajo formacijo lasnice. Pri tem pride do konformacijskih sprememb v UL9, kar povzroči, da izgubi afiniteto do vezave na mesto ori. Izpostaljena ssDNA povzroči konformacijske spremembe v ICP8, ki se nato sprosti z UL9 in se veže na ssDNA in prepreči, da bi se veriga ponovno povezala z drugo.
Kompleks H/P odvije dvoverižno DNA in sintetizira začetni oligonukleotid, a le v primeru, ko ima na voljo vsaj šest nukleotidov dolgo enoverižno verigo. Za vezavo polimeraze na DNA so potrebne konformacijske spremembe v kompleksu H/P in RNA primerju. Ko se polimeraza pritrdi na replikacijske vilice, se začne sinteza vodilne in zastajajoče verige. Ko se replikacijski vilici srečata, iniciatorski protein prereže eno od verig. Nerezana veriga služi kot matrica za replikacijo rezane verige. Pri tem nastane konkatemerna DNA, ki se nato cepi in zapakira.
==Iniciacija transkripcije==
Pri virusu Herpes Simpleks tipa 1 (HSV-1) je znotraj linearnega virusnega genoma, ki je dolg 152 kbp, kodiranih približno 80 genov. Geni se izražajo v treh zaporednih fazah in se prepisujejo s pomočjo celične RNA polimeraze II. Vsi virusni promotorji imajo značilno nukleotidno zaporedje imenovano TATA škatla, ki se nahaja 25 nukleotidov navzgor od začetnega mesta transkripcije. Genom HSV-1 je sestavljen iz treh skupin genov: takojšnji zgodnji, zgodnji in pozni geni.

===Mehanizem===
Prvih pet genov, ki jih je treba pri okužbi prepisati, so takojšnji zgodnji geni, ki se v nukleotidnem zaporedju razlikujejo od zgodnjih in poznih genov. Imajo posebno zaporedje TAATGARA, ki se nahaja navzgor od promotorja. Za začetek izražanja je potreben transkripcijski faktor, ki po vezavi na promotor sproži prepisovanje gena. Vezavno mesto na nukleotidni verigi prepozna protein iz virusnega tegumenta, imenovan protein VP16. Vezava VP16 na molekulo DNA ni možna, če niso prisotni dodatni proteini, ki tvorijo kompleks in na ta način vezavo stabilizirajo ter sprožijo prepisovanje gena. Kompleks tvorijo protein VP16 in dva dodatna proteina gostiteljske celice, HCF in Oct-1. HCF stabilizira vezavo na nukleotidnem zaporedju, dokler Oct-1 ne aktivira RNA polimeraze II. RNA polimeraza II začne prepisovati nukleotidno zaporedje v mRNA. Po sintezi mRNA sledi zorenje mRNA in njen prenos do citosolnih celičnih ribosomov, kjer pride do translacije kodona in sinteze α proteinov. Enako kot pri takojšnjih zgodnjih genih tudi zgodnji in pozni geni potrebujejo virusno kodirani transkripcijski faktor, ki iniciira začetek transkripcije. Ta se imenuje ICP4 in eden od proteinov α. Zapisan je na takojšnjih zgodnjih genih. ICP4 je jedrni fosfoprotein, ki deluje kot homodimer za aktivacijo ali utišanje transkripcije, odvisno od promotorja, na katerega se veže. ICP4 je nujno potreben za izražanje zgodnjih in poznih genov. V odsotnosti transkripcijskega faktorja ICP4 so zgodnji geni slabo izraženi, takojšnji zgodnji geni pa so prekomerno izraženi. Prekomerno izražanje teh genov povzroči, da ICP4 prepreči transkripcijo svojega lastnega promotorja in nekaterih drugih promotorjev na takojšnjih zgodnjih genih. Vezava ICP4 na promotorske regije zgodnjih in poznih genov je bistvena za začetek transkripcije samega gena. ICP4 tvori trimer v območju TATA škatle. V trimeru se poveže s TBP in TFIIB. Ta povezava stabilizira vezavo TAF250 na DNA in tako aktivira RNA polimerazo II, ki začne transkripcijo genov. Sintetizirani mRNA sledi zorenje in prenos do citosolnih ribosomov. V tej skupini genov na ribosomih poteka translacija proteinov β, ki so večinoma dejavniki prepisovanja poznih genov ali encimi (UL9, vezavni DNA protein UL29(ICP8), DNA polimeraza, timidinska kinaza). Naslednja faza je transkripcija poznih genov in sinteza strukturnih proteinov na citoplazemskih ribosomih. Tudi pri tej skupini genov je seveda izražanje nadzorovano. Eden izmed glavnih proteinov, ki aktivira transkripcijo poznih genov, je protein ICP4. Drugi protein je ICP8, ki ima pomembno vlogo pri podvojevanju virusne DNA, v tej skupini genov pa transkripcijo zavira. Mehanizem regulacije izražanja poznih genov ni natančno določen, a znano je, da visoka koncntracija prostega proteina IPC8 močno utiša transkripcijo poznih genov in posledično sintezo strukturnih proteinov γ.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato zreli virusi skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra, potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

==Širjenje virusov iz celice v celico==
Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400
*Weller, S. K., Coen, D. M. Herpes Simplex Viruses: Mechanisms of DNA Replication. Cold Spring Habor Perspective in Biology, 2012, 4 (9), str. 1-15
*Kim D., Zabierowski S., DeLuca N. A. The initiator element in a herpes simplex virus type 1 late-gene promoter enhances activation by ICP4, resulting in abundant late gene expression. J. Virol. 2002;76:1548–1558
*Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis - PubMed - NCBI. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21348071. Accessed April 13, 2018.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-14T11:19:07Z

Veronika Razpotnik: /* Iniciacija transkripcije */

==Uvod==
Herpesvirusi so velika družina virusov, ki imajo dvojnovijačno DNA. Ostali predstavniki takšnih virusov so adenovirus, poksivirusi, papilomavirus in vacinia virus. Poznamo osem vrst herpesvirusov, ki jih delimo v tri poddružine, in sicer α, β in γ. Herpesvirusi α se nahajajo v živčnih ganglijih gostitelja. Zanje je značilno hitro podvojevanje. Herpesvirusi β povzročajo močno povečanje okužene celice, herpesvirusi γ pa pogosto povezujemo z nastankom raka. V seminarski nalogi se bomo osredotočili na hespesvirus simpleks 1.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Replikacija==
===Genom===
Genom herpesvirusa je velik, kompleksen in krožen. Sestavljen je iz dveh regij UL in US. Vsebuje tri mesta replikacije, in sicer oriL in oriS, ki se pojavi v dveh kopijah. Obe mesti replikacije vsebujeta z adenozini in timini bogato regijo, v bližini katere je veliko prepoznavnih mest za ori-vezavne proteine.
Genom kodira sedem proteinov, ki so esencialni za replikacijo. UL9 kodira za protein, ki veže proteine na mesto ori, poleg tega pa ima tudi helikazno funkcijo. UL30 kodira za katalitično podenoto DNA polimeraze, UL42 pa za procesivno enoto. UL5, UL8 in UL52 kodirajo za protein, ki je podenota helikaznega-primaznega kompleksa (H/P kompleks), vsak pa ima drugačno funkcijo. UL5 vsebuje helikazni, UL52 pa primazni motiv. Funkcija UL8 je ta, da interagira z drugimi proteini. Poleg teh je zelo pomemben še gen UL29 (ICP8), ki kodira za ssDNA-vezavne proteine.

===Mehanizem replikacije===
Proces replikacije se začne na enem od mest ori, ki vsebuje UL9 in ICP8. UL9 in ICP8 delujeta tako, da popačita z adenini in timini bogato regijo in destabilizirata mesto ori. To se zgodi tako, da se dva UL9 dimera vežeta na škatli I in II ter skupaj z ICP8, v prisotnosti ATP, inducirajo formacijo lasnice. Pri tem pride do konformacijskih sprememb v UL9, kar povzroči, da izgubi afiniteto do vezave na mesto ori. Izpostaljena ssDNA povzroči konformacijske spremembe v ICP8, ki se nato sprosti z UL9 in se veže na ssDNA in prepreči, da bi se veriga ponovno povezala z drugo.
Kompleks H/P odvije dvoverižno DNA in sintetizira začetni oligonukleotid, a le v primeru, ko ima na voljo vsaj šest nukleotidov dolgo enoverižno verigo. Za vezavo polimeraze na DNA so potrebne konformacijske spremembe v kompleksu H/P in RNA primerju. Ko se polimeraza pritrdi na replikacijske vilice, se začne sinteza vodilne in zastajajoče verige. Ko se replikacijski vilici srečata, iniciatorski protein prereže eno od verig. Nerezana veriga služi kot matrica za replikacijo rezane verige. Pri tem nastane konkatemerna DNA, ki se nato cepi in zapakira.
==Iniciacija transkripcije==
Pri virusu Herpes Simpleks tipa 1 (HSV-1) je znotraj linearnega virusnega genoma, ki je dolg 152 kbp, kodiranih približno 80 genov. Geni se izražajo v treh zaporednih fazah in se prepisujejo s pomočjo celične RNA polimeraze II. Vsi virusni promotorji imajo značilno nukleotidno zaporedje imenovano TATA škatla, ki se nahaja 25 nukleotidov navzgor od začetnega mesta transkripcije. Genom HSV-1 je sestavljen iz treh skupin genov: takojšnji zgodnji, zgodnji in pozni geni.

===Mehanizem===
Prvih pet genov, ki jih je treba pri okužbi prepisati, so takojšnji zgodnji geni, ki se v nukleotidnem zaporedju razlikujejo od zgodnjih in poznih genov. Imajo posebno zaporedje TAATGARA, ki se nahaja navzgor od promotorja. Za začetek izražanja je potreben transkripcijski faktor, ki po vezavi na promotor sproži prepisovanje gena. Vezavno mesto na nukleotidni verigi prepozna protein iz virusnega tegumenta, imenovan protein VP16. Vezava VP16 na molekulo DNA ni možna, če niso prisotni dodatni proteini, ki tvorijo kompleks in na ta način vezavo stabilizirajo ter sprožijo prepisovanje gena. Kompleks tvorijo protein VP16 in dva dodatna proteina gostiteljske celice, HCF in Oct-1. HCF stabilizira vezavo na nukleotidnem zaporedju, dokler Oct-1 ne aktivira RNA polimeraze II. RNA polimeraza II začne prepisovati nukleotidno zaporedje v mRNA. Po sintezi mRNA sledi zorenje mRNA in njen prenos do citosolnih celičnih ribosomov, kjer pride do translacije kodona in sinteze α proteinov. Enako kot pri takojšnjih zgodnjih genih tudi zgodnji in pozni geni potrebujejo virusno kodirani transkripcijski faktor, ki iniciira začetek transkripcije. Ta se imenuje ICP4 in eden od proteinov α. Zapisan je na takojšnjih zgodnjih genih. ICP4 je jedrni fosfoprotein, ki deluje kot homodimer za aktivacijo ali utišanje transkripcije, odvisno od promotorja, na katerega se veže. ICP4 je nujno potreben za izražanje zgodnjih in poznih genov. V odsotnosti transkripcijskega faktorja ICP4 so zgodnji geni slabo izraženi, takojšnji zgodnji geni pa so prekomerno izraženi. Prekomerno izražanje teh genov povzroči, da ICP4 prepreči transkripcijo svojega lastnega promotorja in nekaterih drugih promotorjev na takojšnjih zgodnjih genih. Vezava ICP4 na promotorske regije zgodnjih in poznih genov je bistvena za začetek transkripcije samega gena. ICP4 tvori trimer v območju TATA škatle. V trimeru se poveže s TBP in TFIIB. Ta povezava stabilizira vezavo TAF250 na DNA in tako aktivira RNA polimerazo II, ki začne transkripcijo genov. Sintetizirani mRNA sledi zorenje in prenos do citosolnih ribosomov. V tej skupini genov na ribosomih poteka translacija proteinov β, ki so večinoma dejavniki prepisovanja poznih genov ali encimi (UL9, vezavni DNA protein UL29(ICP8), DNA polimeraza, timidinska kinaza). Naslednja faza je transkripcija poznih genov in sinteza strukturnih proteinov na citoplazemskih ribosomih. Tudi pri tej skupini genov je seveda izražanje nadzorovano. Eden izmed glavnih proteinov, ki aktivira transkripcijo poznih genov, je protein ICP4. Drugi protein je ICP8, ki ima pomembno vlogo pri podvojevanju virusne DNA, v tej skupini genov pa transkripcijo zavira. Mehanizem regulacije izražanja poznih genov ni natančno določen, a znano je, da visoka koncntracija prostega proteina IPC8 močno utiša transkripcijo poznih genov in posledično sintezo strukturnih proteinov γ.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato zreli virusi skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra, potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400
*Weller, S. K., Coen, D. M. Herpes Simplex Viruses: Mechanisms of DNA Replication. Cold Spring Habor Perspective in Biology, 2012, 4 (9), str. 1-15
*Kim D., Zabierowski S., DeLuca N. A. The initiator element in a herpes simplex virus type 1 late-gene promoter enhances activation by ICP4, resulting in abundant late gene expression. J. Virol. 2002;76:1548–1558
*Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis - PubMed - NCBI. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21348071. Accessed April 13, 2018.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-13T20:31:11Z

Veronika Razpotnik: /* Genom */

==Uvod==
Herpesvirusi so velika družina virusov, ki imajo dvojnovijačno DNA. Ostali predstavniki takšnih virusov so adenovirus, poksivirusi, papilomavirus in vacinia virus. Poznamo osem vrst herpesvirusov, ki jih delimo v tri poddružine, in sicer α, β in γ. Herpesvirusi α se nahajajo v živčnih ganglijih gostitelja. Zanje je značilno hitro podvojevanje. Herpesvirusi β povzročajo močno povečanje okužene celice, herpesvirusi γ pa pogosto povezujemo z nastankom raka. V seminarski nalogi se bomo osredotočili na hespesvirus simpleks 1.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Replikacija==
===Genom===
Genom herpesvirusa je velik, kompleksen in krožen. Sestavljen je iz dveh regij UL in US. Vsebuje tri mesta replikacije, in sicer oriL in oriS, ki se pojavi v dveh kopijah. Obe mesti replikacije vsebujeta z adenozini in timini bogato regijo, v bližini katere je veliko prepoznavnih mest za ori-vezavne proteine.
Genom kodira sedem proteinov, ki so esencialni za replikacijo. UL9 kodira za protein, ki veže proteine na mesto ori, poleg tega pa ima tudi helikazno funkcijo. UL30 kodira za katalitično podenoto DNA polimeraze, UL42 pa za procesivno enoto. UL5, UL8 in UL52 kodirajo za protein, ki je podenota helikaznega-primaznega kompleksa (H/P kompleks), vsak pa ima drugačno funkcijo. UL5 vsebuje helikazni, UL52 pa primazni motiv. Funkcija UL8 je ta, da interagira z drugimi proteini. Poleg teh je zelo pomemben še gen UL29 (ICP8), ki kodira za ssDNA-vezavne proteine.

===Mehanizem replikacije===
Proces replikacije se začne na enem od mest ori, ki vsebuje UL9 in ICP8. UL9 in ICP8 delujeta tako, da popačita z adenini in timini bogato regijo in destabilizirata mesto ori. To se zgodi tako, da se dva UL9 dimera vežeta na škatli I in II ter skupaj z ICP8, v prisotnosti ATP, inducirajo formacijo lasnice. Pri tem pride do konformacijskih sprememb v UL9, kar povzroči, da izgubi afiniteto do vezave na mesto ori. Izpostaljena ssDNA povzroči konformacijske spremembe v ICP8, ki se nato sprosti z UL9 in se veže na ssDNA in prepreči, da bi se veriga ponovno povezala z drugo.
Kompleks H/P odvije dvoverižno DNA in sintetizira začetni oligonukleotid, a le v primeru, ko ima na voljo vsaj šest nukleotidov dolgo enoverižno verigo. Za vezavo polimeraze na DNA so potrebne konformacijske spremembe v kompleksu H/P in RNA primerju. Ko se polimeraza pritrdi na replikacijske vilice, se začne sinteza vodilne in zastajajoče verige. Ko se replikacijski vilici srečata, iniciatorski protein prereže eno od verig. Nerezana veriga služi kot matrica za replikacijo rezane verige. Pri tem nastane konkatemerna DNA, ki se nato cepi in zapakira.
==Iniciacija transkripcije==
Pri virusu Herpes Simpleks tipa 1 (HSV-1) je znotraj linearnega virusnega genoma, ki je dolg 152 kbp, kodiranih približno 80 genov. Geni se izražajo v treh zaporednih fazah in se prepisujejo s pomočjo celične RNA polimeraze II. Vsi virusni promotorji imajo značilno nukleotidno zaporedje imenovano TATA škatla, ki se nahaja 25 nukleotidov navzgor od začetnega mesta transkripcije. Genom HSV-1 je sestavljen iz treh skupin genov: najzgodnejši, zgodnji in pozni geni.

===Mehanizem===
Prvih pet genov, ki jih je treba pri okužbi prepisati, so najzgodnejši geni, ki se v nukleotidnem zaporedju razlikujejo od zgodnjih in poznih genov. Imajo posebno zaporedje TAATGARA, ki se nahaja navzgor od promotorja. Za začetek izražanja je potreben transkripcijski faktor, ki po vezavi na promotor sproži prepisovanje gena. Vezavno mesto na nukleotidni verigi prepozna protein iz virusnega tegumenta, imenovan protein VP16. Vezava VP16 na molekulo DNA ni možna, če niso prisotni dodatni proteini, ki tvorijo kompleks in na ta način vezavo stabilizirajo ter sprožijo prepisovanje gena. Kompleks tvorijo protein VP16 in dva dodatna proteina gostiteljske celice, HCF in Oct-1. HCF stabilizira vezavo na nukleotidnem zaporedju, dokler Oct-1 ne aktivira RNA polimeraze II. RNA polimeraza II začne prepisovati nukleotidno zaporedje v mRNA. Po sintezi mRNA sledi zorenje mRNA in njen prenos do citosolnih celičnih ribosomov, kjer pride do translacije kodona in sinteze α proteinov. Enako kot pri najzgodnejših genih tudi zgodnji in pozni geni potrebujejo virusno kodirani transkripcijski faktor, ki iniciira začetek transkripcije. Ta se imenuje ICP4. To je eden od proteinov α. Zapisan je na najzgodnejših genih. ICP4 je jedrni fosfoprotein, ki deluje kot homodimer za aktivacijo ali utišanje transkripcije, odvisno od promotorja, na katerega se veže. ICP4 je nujno potreben za izražanje zgodnjih in poznih genov. V odsotnosti transkripcijskega faktorja ICP4 so zgodnji geni slabo izraženi, najzgodnejši geni pa so prekomerno izraženi. Prekomerno izražanje teh genov povzroči, da ICP4 prepreči transkripcijo svojega lastnega promotorja in nekaterih drugih promotorjev na najzgodnejših genih. Vezava ICP4 na promotorske regije zgodnjih in poznih genov je bistvena za začetek transkripcije samega gena. ICP4 tvori trimer v območju TATA škatle. V trimeru se poveže s TBP in TFIIB. Ta povezava stabilizira vezavo TAF250 na DNA in tako aktivira RNA polimerazo II, ki začne transkripcijo genov. Sintetizirani mRNA sledi zorenje in prenos do citosolnih ribosomov. V tej skupini genov na ribosomih poteka translacija proteinov β, ki so večinoma dejavniki prepisovanja poznih genov ali encimi (UL9, vezavni DNA protein UL29(ICP8), DNA polimeraza, timidinska kinaza). Naslednja faza je transkripcija poznih genov in sinteza strukturnih proteinov na citoplazemskih ribosomih. Tudi pri tej skupini genov je seveda izražanje nadzorovano. Eden izmed glavnih proteinov, ki aktivira transkripcijo poznih genov, je protein ICP4. Drugi protein je ICP8, ki ima pomembno vlogo pri podvojevanju virusne DNA, v tej skupini genov pa transkripcijo zavira. Mehanizem regulacije izražanja poznih genov ni natančno določen, a znano je, da visoka koncntracija prostega proteina IPC8 močno utiša transkripcijo poznih genov in posledično sintezo strukturnih proteinov γ.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato zreli virusi skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra, potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400
*Weller, S. K., Coen, D. M. Herpes Simplex Viruses: Mechanisms of DNA Replication. Cold Spring Habor Perspective in Biology, 2012, 4 (9), str. 1-15
*Kim D., Zabierowski S., DeLuca N. A. The initiator element in a herpes simplex virus type 1 late-gene promoter enhances activation by ICP4, resulting in abundant late gene expression. J. Virol. 2002;76:1548–1558
*Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis - PubMed - NCBI. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21348071. Accessed April 13, 2018.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-13T20:28:45Z

Veronika Razpotnik: /* Mehanizem */

==Uvod==
Herpesvirusi so velika družina virusov, ki imajo dvojnovijačno DNA. Ostali predstavniki takšnih virusov so adenovirus, poksivirusi, papilomavirus in vacinia virus. Poznamo osem vrst herpesvirusov, ki jih delimo v tri poddružine, in sicer α, β in γ. Herpesvirusi α se nahajajo v živčnih ganglijih gostitelja. Zanje je značilno hitro podvojevanje. Herpesvirusi β povzročajo močno povečanje okužene celice, herpesvirusi γ pa pogosto povezujemo z nastankom raka. V seminarski nalogi se bomo osredotočili na hespesvirus simpleks 1.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Replikacija==
===Genom===
Genom herpesvirusa je veliki, kompleksen in krožen. Sestavljen je iz dveh regij UL in US. Vsebuje tri mesta replikacije, in sicer oriL in oriS, ki se pojavi v dveh kopijah. Obe mesti replikacije vsebujeta z adenozini in timini bogato regijo, v bližini katere je veliko prepoznavnih mest za ori-vezavne proteine.
Genom kodira sedem proteinov, ki so esencialni za replikacijo. UL9 kodira za protein, ki veže proteine na mesto ori, poleg tega pa ima tudi helikazno funkcijo. UL30 kodira za katalitično podenoto DNA polimeraze, UL42 pa za procesivno enoto. UL5, UL8 in UL52 kodirajo za protein, ki je podenota helikaznega-primaznega kompleksa (H/P kompleks), vsak pa ima drugačno funkcijo. UL5 vsebuje helikazni, UL52 pa primazni motiv. Funkcija UL8 je ta, da interagira z drugimi proteini. Poleg teh je zelo pomemben še gen UL29 (ICP8), ki kodira za ssDNA-vezavne proteine.

===Mehanizem replikacije===
Proces replikacije se začne na enem od mest ori, ki vsebuje UL9 in ICP8. UL9 in ICP8 delujeta tako, da popačita z adenini in timini bogato regijo in destabilizirata mesto ori. To se zgodi tako, da se dva UL9 dimera vežeta na škatli I in II ter skupaj z ICP8, v prisotnosti ATP, inducirajo formacijo lasnice. Pri tem pride do konformacijskih sprememb v UL9, kar povzroči, da izgubi afiniteto do vezave na mesto ori. Izpostaljena ssDNA povzroči konformacijske spremembe v ICP8, ki se nato sprosti z UL9 in se veže na ssDNA in prepreči, da bi se veriga ponovno povezala z drugo.
Kompleks H/P odvije dvoverižno DNA in sintetizira začetni oligonukleotid, a le v primeru, ko ima na voljo vsaj šest nukleotidov dolgo enoverižno verigo. Za vezavo polimeraze na DNA so potrebne konformacijske spremembe v kompleksu H/P in RNA primerju. Ko se polimeraza pritrdi na replikacijske vilice, se začne sinteza vodilne in zastajajoče verige. Ko se replikacijski vilici srečata, iniciatorski protein prereže eno od verig. Nerezana veriga služi kot matrica za replikacijo rezane verige. Pri tem nastane konkatemerna DNA, ki se nato cepi in zapakira.
==Iniciacija transkripcije==
Pri virusu Herpes Simpleks tipa 1 (HSV-1) je znotraj linearnega virusnega genoma, ki je dolg 152 kbp, kodiranih približno 80 genov. Geni se izražajo v treh zaporednih fazah in se prepisujejo s pomočjo celične RNA polimeraze II. Vsi virusni promotorji imajo značilno nukleotidno zaporedje imenovano TATA škatla, ki se nahaja 25 nukleotidov navzgor od začetnega mesta transkripcije. Genom HSV-1 je sestavljen iz treh skupin genov: najzgodnejši, zgodnji in pozni geni.

===Mehanizem===
Prvih pet genov, ki jih je treba pri okužbi prepisati, so najzgodnejši geni, ki se v nukleotidnem zaporedju razlikujejo od zgodnjih in poznih genov. Imajo posebno zaporedje TAATGARA, ki se nahaja navzgor od promotorja. Za začetek izražanja je potreben transkripcijski faktor, ki po vezavi na promotor sproži prepisovanje gena. Vezavno mesto na nukleotidni verigi prepozna protein iz virusnega tegumenta, imenovan protein VP16. Vezava VP16 na molekulo DNA ni možna, če niso prisotni dodatni proteini, ki tvorijo kompleks in na ta način vezavo stabilizirajo ter sprožijo prepisovanje gena. Kompleks tvorijo protein VP16 in dva dodatna proteina gostiteljske celice, HCF in Oct-1. HCF stabilizira vezavo na nukleotidnem zaporedju, dokler Oct-1 ne aktivira RNA polimeraze II. RNA polimeraza II začne prepisovati nukleotidno zaporedje v mRNA. Po sintezi mRNA sledi zorenje mRNA in njen prenos do citosolnih celičnih ribosomov, kjer pride do translacije kodona in sinteze α proteinov. Enako kot pri najzgodnejših genih tudi zgodnji in pozni geni potrebujejo virusno kodirani transkripcijski faktor, ki iniciira začetek transkripcije. Ta se imenuje ICP4. To je eden od proteinov α. Zapisan je na najzgodnejših genih. ICP4 je jedrni fosfoprotein, ki deluje kot homodimer za aktivacijo ali utišanje transkripcije, odvisno od promotorja, na katerega se veže. ICP4 je nujno potreben za izražanje zgodnjih in poznih genov. V odsotnosti transkripcijskega faktorja ICP4 so zgodnji geni slabo izraženi, najzgodnejši geni pa so prekomerno izraženi. Prekomerno izražanje teh genov povzroči, da ICP4 prepreči transkripcijo svojega lastnega promotorja in nekaterih drugih promotorjev na najzgodnejših genih. Vezava ICP4 na promotorske regije zgodnjih in poznih genov je bistvena za začetek transkripcije samega gena. ICP4 tvori trimer v območju TATA škatle. V trimeru se poveže s TBP in TFIIB. Ta povezava stabilizira vezavo TAF250 na DNA in tako aktivira RNA polimerazo II, ki začne transkripcijo genov. Sintetizirani mRNA sledi zorenje in prenos do citosolnih ribosomov. V tej skupini genov na ribosomih poteka translacija proteinov β, ki so večinoma dejavniki prepisovanja poznih genov ali encimi (UL9, vezavni DNA protein UL29(ICP8), DNA polimeraza, timidinska kinaza). Naslednja faza je transkripcija poznih genov in sinteza strukturnih proteinov na citoplazemskih ribosomih. Tudi pri tej skupini genov je seveda izražanje nadzorovano. Eden izmed glavnih proteinov, ki aktivira transkripcijo poznih genov, je protein ICP4. Drugi protein je ICP8, ki ima pomembno vlogo pri podvojevanju virusne DNA, v tej skupini genov pa transkripcijo zavira. Mehanizem regulacije izražanja poznih genov ni natančno določen, a znano je, da visoka koncntracija prostega proteina IPC8 močno utiša transkripcijo poznih genov in posledično sintezo strukturnih proteinov γ.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato zreli virusi skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra, potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400
*Weller, S. K., Coen, D. M. Herpes Simplex Viruses: Mechanisms of DNA Replication. Cold Spring Habor Perspective in Biology, 2012, 4 (9), str. 1-15
*Kim D., Zabierowski S., DeLuca N. A. The initiator element in a herpes simplex virus type 1 late-gene promoter enhances activation by ICP4, resulting in abundant late gene expression. J. Virol. 2002;76:1548–1558
*Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis - PubMed - NCBI. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21348071. Accessed April 13, 2018.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-13T20:22:07Z

Veronika Razpotnik: /* Iniciacija transkripcije */

==Uvod==
Herpesvirusi so velika družina virusov, ki imajo dvojnovijačno DNA. Ostali predstavniki takšnih virusov so adenovirus, poksivirusi, papilomavirus in vacinia virus. Poznamo osem vrst herpesvirusov, ki jih delimo v tri poddružine, in sicer α, β in γ. Herpesvirusi α se nahajajo v živčnih ganglijih gostitelja. Zanje je značilno hitro podvojevanje. Herpesvirusi β povzročajo močno povečanje okužene celice, herpesvirusi γ pa pogosto povezujemo z nastankom raka. V seminarski nalogi se bomo osredotočili na hespesvirus simpleks 1.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Replikacija==
===Genom===
Genom herpesvirusa je veliki, kompleksen in krožen. Sestavljen je iz dveh regij UL in US. Vsebuje tri mesta replikacije, in sicer oriL in oriS, ki se pojavi v dveh kopijah. Obe mesti replikacije vsebujeta z adenozini in timini bogato regijo, v bližini katere je veliko prepoznavnih mest za ori-vezavne proteine.
Genom kodira sedem proteinov, ki so esencialni za replikacijo. UL9 kodira za protein, ki veže proteine na mesto ori, poleg tega pa ima tudi helikazno funkcijo. UL30 kodira za katalitično podenoto DNA polimeraze, UL42 pa za procesivno enoto. UL5, UL8 in UL52 kodirajo za protein, ki je podenota helikaznega-primaznega kompleksa (H/P kompleks), vsak pa ima drugačno funkcijo. UL5 vsebuje helikazni, UL52 pa primazni motiv. Funkcija UL8 je ta, da interagira z drugimi proteini. Poleg teh je zelo pomemben še gen UL29 (ICP8), ki kodira za ssDNA-vezavne proteine.

===Mehanizem replikacije===
Proces replikacije se začne na enem od mest ori, ki vsebuje UL9 in ICP8. UL9 in ICP8 delujeta tako, da popačita z adenini in timini bogato regijo in destabilizirata mesto ori. To se zgodi tako, da se dva UL9 dimera vežeta na škatli I in II ter skupaj z ICP8, v prisotnosti ATP, inducirajo formacijo lasnice. Pri tem pride do konformacijskih sprememb v UL9, kar povzroči, da izgubi afiniteto do vezave na mesto ori. Izpostaljena ssDNA povzroči konformacijske spremembe v ICP8, ki se nato sprosti z UL9 in se veže na ssDNA in prepreči, da bi se veriga ponovno povezala z drugo.
Kompleks H/P odvije dvoverižno DNA in sintetizira začetni oligonukleotid, a le v primeru, ko ima na voljo vsaj šest nukleotidov dolgo enoverižno verigo. Za vezavo polimeraze na DNA so potrebne konformacijske spremembe v kompleksu H/P in RNA primerju. Ko se polimeraza pritrdi na replikacijske vilice, se začne sinteza vodilne in zastajajoče verige. Ko se replikacijski vilici srečata, iniciatorski protein prereže eno od verig. Nerezana veriga služi kot matrica za replikacijo rezane verige. Pri tem nastane konkatemerna DNA, ki se nato cepi in zapakira.
==Iniciacija transkripcije==
Pri virusu Herpes Simpleks tipa 1 (HSV-1) je znotraj linearnega virusnega genoma, ki je dolg 152 kbp, kodiranih približno 80 genov. Geni se izražajo v treh zaporednih fazah in se prepisujejo s pomočjo celične RNA polimeraze II. Vsi virusni promotorji imajo značilno nukleotidno zaporedje imenovano TATA škatla, ki se nahaja 25 nukleotidov navzgor od začetnega mesta transkripcije. Genom HSV-1 je sestavljen iz treh skupin genov: najzgodnejši, zgodnji in pozni geni.

===Mehanizem===
Prvih pet genov, ki jih je treba pri okužbi prepisati, so najzgodnejši geni, ki se v nukleotidnem zaporedju razlikujejo od zgodnjih in poznih genov. Imajo posebno zaporedje TAATGARA, ki se nahaja navzgor od promotorja. Za začetek izražanja je potreben transkripcijski faktor, ki po vezavi na promotor sproži prepisovanje gena. Vezavno mesto na nukleotidni verigi prepozna protein iz virusnega tegumenta, imenovan protein VP16. Vezava VP16 na molekulo DNA ni možna, če niso prisotni dodatni proteini, ki tvorijo kompleks in na ta način vezavo stabilizirajo ter sprožijo prepisovanje gena. Kompleks tvorijo protein VP16 in dva dodatna proteina gostiteljske celice, HCF in Oct-1. HCF stabilizira vezavo na nukleotidnem zaporedju, dokler Oct-1 ne aktivira RNA polimeraze II. RNA polimeraza II začne prepisovati nukleotidno zaporedje v mRNA. Po sintezi mRNA sledi zorenje mRNA in njen prenos do citosolnih celičnih ribosomov, kjer pride do translacije kodona in sinteze α proteinov. Enako kot pri najzgodnejših genih tudi zgodnji in pozni geni potrebujejo virusno kodirani transkripcijski faktor, ki inicira začetek transkripcije. Trankripcijski faktor, ki je potreben, se imenuje ICP4. To je eden od proteinov α. Zapisan je na najzgodnejših genih. ICP4 je jedrni fosfoprotein, ki deluje kot homodimer za aktivacijo ali utišanje transkripcije, odvisno od promotorja, na katerega se veže. ICP4 je nujno potreben za izražanje zgodnjih in poznih genov. V odsotnosti transkripcijskega faktorja ICP4 so zgodnji geni slabo izraženi, najzgodnejši geni pa so prekomerno izraženi. Prekomerno izražanje teh genov povzroči, da ICP4 prepreči transkripcijo svojega lastnega promotorja in nekaterih drugih promotorjev na najzgodnejših genih. Vezava ICP4 na promotorske regije zgodnjih in poznih genov je bistvena za začetek transkripcije samega gena. ICP4 tvori trimer v območju TATA škatle. V trimeru se poveže s TBP in TFIIB. Ta povezava stabilizira vezavo TAF250 na DNA in tako aktivira RNA polimerazo II, ki začne transkripcijo genov. Sintetizirani mRNA sledi zorenje in prenos do citosolnih ribosomov. V tej skupini genov na ribosomih poteka translacija proteinov β, ki so večinoma dejavniki prepisovanja poznih genov ali encimi (UL9, vezavni DNA protein UL29(ICP8), DNA polimeraza, timidinska kinaza). Naslednja faza je transkripcija poznih genov in sinteza strukturnih proteinov na citoplazemskih ribosomih. Tudi pri tej skupini genov je seveda izražanje nadzorovano. Eden izmed glavnih proteinov, ki aktivira transkripcijo poznih genov, je protein ICP4. Drugi protein je ICP8, ki ima pomembno vlogo pri podvojevanju virusne DNA, v tej skupini genov pa transkripcijo zavira. Mehanizem regulacije izražanja poznih genov ni natančno določen, a znano je, da visoka koncntracija prostega proteina IPC8 močno utiša transkripcijo poznih genov in posledično sintezo strukturnih proteinov γ.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato zreli virusi skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra, potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400
*Weller, S. K., Coen, D. M. Herpes Simplex Viruses: Mechanisms of DNA Replication. Cold Spring Habor Perspective in Biology, 2012, 4 (9), str. 1-15
*Kim D., Zabierowski S., DeLuca N. A. The initiator element in a herpes simplex virus type 1 late-gene promoter enhances activation by ICP4, resulting in abundant late gene expression. J. Virol. 2002;76:1548–1558
*Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis - PubMed - NCBI. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21348071. Accessed April 13, 2018.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Molekularna biologija virusov

2018-04-13T18:35:10Z

Veronika Razpotnik:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2017/18 obravnavajo področje virusov, saj v naslednjem letu ne boste imeli možnosti vpisa izbirnega predmeta Virologija. Tematika je razdeljena na 16 poglavij. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu.

Vsako temo obdelata praviloma dva študenta, nekatere teme pa omogočajo tudi razdelitev snovi na tri dele (to je označeno na prvem seznamu). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili.
Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov!

Predstavitve seminarjev po datumih so razvidne iz spletne učilnice.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (lahko 3) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (lahko 3) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi (lahko 3) 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Diagnostika virusnih okužb 
13. Rastlinski virusi (lahko 3) 
14. Protivirusna zdravila (lahko 3) 
15. Protivirusna cepiva 
16. Virusi in rak 
17. Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (Ines Medved, Veronika Razpotnik, Andrej Ivanovski) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi (Milica Jankovic, Andrej Race) 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi (Anže Jenko, Ana Maklin) 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi (Tanja Zupan, Ajda Krč) 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi (Anja Černe, Špela Deučman) 
6. Retrovirusi (Katja Doberšek, Špela Supej, Barbara Slapnik) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) (Nika Zaveršek, Nika Goršek) 
8. Nitasti fagi () 
9. Ikozaedrični fagi (Urban Hribar, Luka Gregorič, Luka Fratina) 
10. Viroidi in satelitski virusi (Lea Knez, Patrik Levačić) 
11. Evolucija virusov () 
12. Diagnostika virusnih okužb (Samo Purič, Peter Škrinjar) 
13. Rastlinski virusi (Katja Dolenc, Martin Špendl) 
14. Protivirusna zdravila (Tina Turel, Maja Vrabec, Polona Skrt) 
15. Protivirusna cepiva (Daria Latysheva, Jerneja Nimac) 
16. Virusi in rak (Ana Obaha, Lija Srnovršnik) 
17. Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju (Andreja Habič, Uroš Prešern)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, ki vsebuje povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 
Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Talk:Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-13T18:30:11Z

Veronika Razpotnik:

Informacije o delitvi dela med referenti:

Ines Medved: Uvod, replikacija

Veronika Razpotnik: Okužbeni cikel, struktura in sestavljanje virusne ovojnice

Andrej Ivanovski: Iniciacija transkripcije

Talk:Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-13T18:29:56Z

Veronika Razpotnik: New page: Informacije o delitvi dela med referenti: Ines Medved: Uvod, replikacija Veronika Razpotnik: Okužbeni cikel, struktura in sestavljanje virusne ovojnice Andrej Ivanovski: Iniciacija trans...

Informacije o delitvi dela med referenti:

Ines Medved: Uvod, replikacija
Veronika Razpotnik: Okužbeni cikel, struktura in sestavljanje virusne ovojnice
Andrej Ivanovski: Iniciacija transkripcije

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-13T18:20:57Z

Veronika Razpotnik: /* Uvod */

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-13T18:20:15Z

Veronika Razpotnik:

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-12T21:04:25Z

Veronika Razpotnik: /* Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo */

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato zreli virusi skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra, potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.
Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-12T21:00:56Z

Veronika Razpotnik: /* Struktura virusne ovojnice */

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato te skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra. Zreli virusi potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.
Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-12T20:59:42Z

Veronika Razpotnik:

==Struktura virusne ovojnice==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica, izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

==Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato te skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra. Zreli virusi potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

==Okužbeni cikel==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.
Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

==Viri in literatura==
*Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
*Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

2018-04-12T20:56:29Z

Veronika Razpotnik: New page: == Struktura virusne ovojnice == Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalče...

== Struktura virusne ovojnice ==
Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica, izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

== Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo ==
Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico.
Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato te skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra. Zreli virusi potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

== Okužbeni cikel ==
Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki poteka tako, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže na celični membranski receptor, v fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Povežejo se s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo virusni delec. Takoj zatem virus sprosti svojo kapsido in tegumentne proteine v citosol skozi fuzijsko poro. Mehanizem je podoben fagocitozi. V jedro potuje virus vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in sprosti svojo DNA v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.
Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

== Viri in literatura ==
Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6

Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400

Molekularna biologija virusov

2018-04-12T19:22:16Z

Veronika Razpotnik: