Wiki FKKT - User contributions [en]

Talk:Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-12T07:18:51Z

Zala.kramar:

Anja Škarabot: Uvod, Oblikovanje plazmidov, Tumor specifični promotorji, Proizvodnja protiteles, Vnos plazmidov v celice

Tonja Oman Sušnik: Uvod, Oblikovanje plazmidov, Tumor specifični promotorji, Proizvodnja protiteles, Vnos plazmidov v celice

Zala Kramar: Uvod, Oblikovanje plazmidov, Tumor specifični promotorji, Proizvodnja protiteles, Vnos plazmidov v celice

Talk:Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-12T07:16:43Z

Zala.kramar: Created page with "Anja Škarabot: Tonja Oman Sušnik: Zala Kramar:"

Anja Škarabot:
Tonja Oman Sušnik:
Zala Kramar:

Molekularna biologija plazmidov

2024-05-12T07:14:37Z

Zala.kramar:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2023/24 obravnavajo plazmide, ki jih sicer biokemiki poznamo predvsem kot vektorje v DNA-tehnologiji. Pregledali bomo njihovo klasifikacijo, načine podvojevanja in razporejanja v hčerinske celice, njihov prenos s konjugacijo, pomen pri širjenju odpornosti proti antibiotikom. Na koncu si bomo ogledali še nekaj primerov uporabe plazmidov na različnih biotehnoloških in medicinskih področjih. Okvirni naslovi tem so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato praviloma vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200–1800 besed), ki ste jih uporabili. Če izjemoma seminar pripravita dva študenta, je obseg povzetka 1000-1500 besed, če je študent sam, pa 800-1200 besed.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15–20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali, in vključite le malo splošnega uvoda, kjer je mogoče pa izpostavite ključne razlike v procesih med bakterijami, evkarionti in arhejami. Če seminar predstavljata dva študenta, imata na voljo 12-15 minut, če je študent sam, pa 8-10 minut.

Seminarske predstavitve bodo potekale med 24. aprilom in 15. majem 2024. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot sredini termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. ~10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim, tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].

Seznam tem in referenti:

24. april: 
# [[Klasifikacija plazmidov]] (Jan Hvalec, Tjaša Lešnik, Nika Makuc) 
# [[Replikacija plazmidov po mehanizmu téta]] (Nika Janc, Špela Puhov, Lara Ferjančič) 
# [[Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga]] (Tinkara Robek, Lara Pajnhart, Tina Kosovel) 

6. maj: 
# [[Interakcije plazmid - kromosom]] (Špela Longar, Tiara Pšeničnik, Anita Mulalić) 
# [[Razporejanje plazmidov v hčerinski celici]] (Karin Kunstelj, Brina Klinar, Nina Cankar) 
# [[Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami]] (Lana Bajec, Vid Kozel, Domen Trontelj)
# [[Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis]] (Mark Frantar, Simon Kristl, Andraž Snedec) 
# [[Modeli konjugacije med črevesnimi bakterijami]] (Peter Gričar Vintar, Maj Dular) 

8. maj: 
# [[Širjenje odpornosti proti antibiotikom med talnimi bakterijami]] (Uma Jordan Ferbežar, Debora Kociper, Dan Kolnik) 
# [[Vloga plazmidov v bakterijski evoluciji]] (Klara Kolenc, Veronika Trobiš, Teja Mohar) 
# [[Pomen plazmida Ti za patogenost agrobakterij]] (Katarina Gomiršek, Blaž Čerenak, Igor Osterc) 

13. maj: 
# [[Vloga plazmidov pri virulenčnosti klamidij]] (Nik Matek, Mark Varlamov, Anže Perc) 
# [[Kriptični plazmidi v človeških prebavilih]] (Nina Majerle, Jasna Čarman, Patricija Polutnik) 
# [[Vloga plazmidov pri kvarjenju piva, ki ga povzročajo mlečne bakterije]] (Hanna Habot, Vanja Vogrič, Jana Bregar) 
# [[Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev]] (Anja Škarabot, Tonja Oman Sušnik, Zala Kramar) 
# Plazmidni replikoni v farmacevtski industriji

15. maj: 
# Atipična sistema segregacije pri plazmidih z nizkim številom kopij

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-12T07:13:14Z

Zala.kramar: /* Primeri */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9). TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Njegova uporaba se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Timidna kinaza pri tem deluje kot marker, ki ga celice imunskega odziva prepoznajo in zato uničijo celico, ki imajo izražen ta protein. Mišji granulocit-makrofag kolonijski faktor pa deluje imuno stimulatorno in tako ojača odziv imunskega sistema v tumorskem okolju. V obeh primerih so opazili upad v rasti tumorja.

===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledično hitrejšo proliferacijo celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.

===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.
===Primeri===
Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši.

Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk.

Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==
1. Martínez-Puente DH, Pérez-Trujillo JJ, Zavala-Flores LM, et al. Plasmid DNA for Therapeutic Applications in Cancer. Pharmaceutics. 2022;14(9):1861. doi:10.3390/pharmaceutics14091861

2. Markovic M, Ben-Shabat S, Dahan A. Prodrugs for Improved Drug Delivery: Lessons Learned from Recently Developed and Marketed Products. Pharmaceutics. 2020;12(11):1031. doi:10.3390/pharmaceutics12111031

3. Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system. Int J Nanomedicine. 2012;7:2181-2195. doi:10.2147/IJN.S30197

4. Hall RS, Fedorov AA, Xu C, Fedorov EV, Almo SC, Raushel FM. The Three-Dimensional Structure and Catalytic Mechanism of Cytosine Deaminase. Biochemistry. 2011;50(22):5077-5085. doi:10.1021/bi200483k

5. Kaj delamo. Accessed May 12, 2024. https://www.onko-i.si/dejavnosti/raziskovalna_in_izobrazevalna_dejavnost/oddelek_za_eksperimentalno_onkologijo/kaj_delamo

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-12T07:09:44Z

Zala.kramar: /* Oblikovanje plazmidov */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9). TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Njegova uporaba se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Timidna kinaza pri tem deluje kot marker, ki ga celice imunskega odziva prepoznajo in zato uničijo celico, ki imajo izražen ta protein. Mišji granulocit-makrofag kolonijski faktor pa deluje imuno stimulatorno in tako ojača odziv imunskega sistema v tumorskem okolju. V obeh primerih so opazili upad v rasti tumorja.

===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledično hitrejšo proliferacijo celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.

===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.
===Primeri===
Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši.
Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk.
Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==
1. Martínez-Puente DH, Pérez-Trujillo JJ, Zavala-Flores LM, et al. Plasmid DNA for Therapeutic Applications in Cancer. Pharmaceutics. 2022;14(9):1861. doi:10.3390/pharmaceutics14091861

2. Markovic M, Ben-Shabat S, Dahan A. Prodrugs for Improved Drug Delivery: Lessons Learned from Recently Developed and Marketed Products. Pharmaceutics. 2020;12(11):1031. doi:10.3390/pharmaceutics12111031

3. Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system. Int J Nanomedicine. 2012;7:2181-2195. doi:10.2147/IJN.S30197

4. Hall RS, Fedorov AA, Xu C, Fedorov EV, Almo SC, Raushel FM. The Three-Dimensional Structure and Catalytic Mechanism of Cytosine Deaminase. Biochemistry. 2011;50(22):5077-5085. doi:10.1021/bi200483k

5. Kaj delamo. Accessed May 12, 2024. https://www.onko-i.si/dejavnosti/raziskovalna_in_izobrazevalna_dejavnost/oddelek_za_eksperimentalno_onkologijo/kaj_delamo

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-12T07:07:51Z

Zala.kramar: /* Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2) */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9).1 TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Njegova uporaba se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Timidna kinaza pri tem deluje kot marker, ki ga celice imunskega odziva prepoznajo in zato uničijo celico, ki imajo izražen ta protein. Mišji granulocit-makrofag kolonijski faktor pa deluje imuno stimulatorno in tako ojača odziv imunskega sistema v tumorskem okolju. V obeh primerih so opazili upad v rasti tumorja.

===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledično hitrejšo proliferacijo celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.

===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.
===Primeri===
Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši.
Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk.
Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==
1. Martínez-Puente DH, Pérez-Trujillo JJ, Zavala-Flores LM, et al. Plasmid DNA for Therapeutic Applications in Cancer. Pharmaceutics. 2022;14(9):1861. doi:10.3390/pharmaceutics14091861

2. Markovic M, Ben-Shabat S, Dahan A. Prodrugs for Improved Drug Delivery: Lessons Learned from Recently Developed and Marketed Products. Pharmaceutics. 2020;12(11):1031. doi:10.3390/pharmaceutics12111031

3. Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system. Int J Nanomedicine. 2012;7:2181-2195. doi:10.2147/IJN.S30197

4. Hall RS, Fedorov AA, Xu C, Fedorov EV, Almo SC, Raushel FM. The Three-Dimensional Structure and Catalytic Mechanism of Cytosine Deaminase. Biochemistry. 2011;50(22):5077-5085. doi:10.1021/bi200483k

5. Kaj delamo. Accessed May 12, 2024. https://www.onko-i.si/dejavnosti/raziskovalna_in_izobrazevalna_dejavnost/oddelek_za_eksperimentalno_onkologijo/kaj_delamo

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-12T06:43:50Z

Zala.kramar: /* Promotor gena BIRC5 */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9).1 TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Njegova uporaba se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Timidna kinaza pri tem deluje kot marker, ki ga celice imunskega odziva prepoznajo in zato uničijo celico, ki imajo izražen ta protein. Mišji granulocit-makrofag kolonijski faktor pa deluje imuno stimulatorno in tako ojača odziv imunskega sistema v tumorskem okolju. V obeh primerih so opazili upad v rasti tumorja.

===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledični hitrejši proliferaciji celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.
===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.
===Primeri===
Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši.
Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk.
Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==
1. Martínez-Puente DH, Pérez-Trujillo JJ, Zavala-Flores LM, et al. Plasmid DNA for Therapeutic Applications in Cancer. Pharmaceutics. 2022;14(9):1861. doi:10.3390/pharmaceutics14091861

2. Markovic M, Ben-Shabat S, Dahan A. Prodrugs for Improved Drug Delivery: Lessons Learned from Recently Developed and Marketed Products. Pharmaceutics. 2020;12(11):1031. doi:10.3390/pharmaceutics12111031

3. Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system. Int J Nanomedicine. 2012;7:2181-2195. doi:10.2147/IJN.S30197

4. Hall RS, Fedorov AA, Xu C, Fedorov EV, Almo SC, Raushel FM. The Three-Dimensional Structure and Catalytic Mechanism of Cytosine Deaminase. Biochemistry. 2011;50(22):5077-5085. doi:10.1021/bi200483k

5. Kaj delamo. Accessed May 12, 2024. https://www.onko-i.si/dejavnosti/raziskovalna_in_izobrazevalna_dejavnost/oddelek_za_eksperimentalno_onkologijo/kaj_delamo

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-12T06:31:14Z

Zala.kramar: /* Viri */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9).1 TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Uporaba takšnega promotorja se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Tudi v tem primeru so opazili upad v rasti tumorja.
===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledični hitrejši proliferaciji celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.
===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.
===Primeri===
Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši.
Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk.
Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==
1. Martínez-Puente DH, Pérez-Trujillo JJ, Zavala-Flores LM, et al. Plasmid DNA for Therapeutic Applications in Cancer. Pharmaceutics. 2022;14(9):1861. doi:10.3390/pharmaceutics14091861

2. Markovic M, Ben-Shabat S, Dahan A. Prodrugs for Improved Drug Delivery: Lessons Learned from Recently Developed and Marketed Products. Pharmaceutics. 2020;12(11):1031. doi:10.3390/pharmaceutics12111031

3. Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system. Int J Nanomedicine. 2012;7:2181-2195. doi:10.2147/IJN.S30197

4. Hall RS, Fedorov AA, Xu C, Fedorov EV, Almo SC, Raushel FM. The Three-Dimensional Structure and Catalytic Mechanism of Cytosine Deaminase. Biochemistry. 2011;50(22):5077-5085. doi:10.1021/bi200483k

5. Kaj delamo. Accessed May 12, 2024. https://www.onko-i.si/dejavnosti/raziskovalna_in_izobrazevalna_dejavnost/oddelek_za_eksperimentalno_onkologijo/kaj_delamo

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-11T21:49:25Z

Zala.kramar: /* Viri */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9).1 TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Uporaba takšnega promotorja se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Tudi v tem primeru so opazili upad v rasti tumorja.
===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledični hitrejši proliferaciji celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.
===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.
===Primeri===
Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši.
Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk.
Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==
1. Martínez-Puente DH, Pérez-Trujillo JJ, Zavala-Flores LM, et al. Plasmid DNA for Therapeutic Applications in Cancer. Pharmaceutics. 2022;14(9):1861. doi:10.3390/pharmaceutics14091861

2. Markovic M, Ben-Shabat S, Dahan A. Prodrugs for Improved Drug Delivery: Lessons Learned from Recently Developed and Marketed Products. Pharmaceutics. 2020;12(11):1031. doi:10.3390/pharmaceutics12111031

3. Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system. Int J Nanomedicine. 2012;7:2181-2195. doi:10.2147/IJN.S30197

4. Hall RS, Fedorov AA, Xu C, Fedorov EV, Almo SC, Raushel FM. The Three-Dimensional Structure and Catalytic Mechanism of Cytosine Deaminase. Biochemistry. 2011;50(22):5077-5085. doi:10.1021/bi200483k

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-11T21:48:57Z

Zala.kramar: /* Viri */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9).1 TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Uporaba takšnega promotorja se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Tudi v tem primeru so opazili upad v rasti tumorja.
===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledični hitrejši proliferaciji celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.
===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.
===Primeri===
Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši.
Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk.
Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==
1. Martínez-Puente DH, Pérez-Trujillo JJ, Zavala-Flores LM, et al. Plasmid DNA for Therapeutic Applications in Cancer. Pharmaceutics. 2022;14(9):1861. doi:10.3390/pharmaceutics14091861
2. Markovic M, Ben-Shabat S, Dahan A. Prodrugs for Improved Drug Delivery: Lessons Learned from Recently Developed and Marketed Products. Pharmaceutics. 2020;12(11):1031. doi:10.3390/pharmaceutics12111031
3. Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system. Int J Nanomedicine. 2012;7:2181-2195. doi:10.2147/IJN.S30197
4. Hall RS, Fedorov AA, Xu C, Fedorov EV, Almo SC, Raushel FM. The Three-Dimensional Structure and Catalytic Mechanism of Cytosine Deaminase. Biochemistry. 2011;50(22):5077-5085. doi:10.1021/bi200483k

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-11T21:42:47Z

Zala.kramar: /* Proizvodnja protiteles */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9).1 TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Uporaba takšnega promotorja se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Tudi v tem primeru so opazili upad v rasti tumorja.
===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledični hitrejši proliferaciji celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.
===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.
===Primeri===
Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši.
Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk.
Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-11T21:38:10Z

Zala.kramar: /* Vnos plazmidov v celice */

==Uvod==
Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

==Oblikovanje plazmidov==
Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9).1 TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek.
Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša.
Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice.
Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

==Tumor specifični promotorji==
Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic.
hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.
===Promotor gena BIRC5===
Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka.
Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Uporaba takšnega promotorja se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Tudi v tem primeru so opazili upad v rasti tumorja.
===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledični hitrejši proliferaciji celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.
===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.
===Promotor za prostato specifičnega antigena===
Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov.
V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

==Proizvodnja protiteles==
==Vnos plazmidov v celice==
Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice.
Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

==Viri==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-11T21:32:44Z

Zala.kramar: /* Tumor specifični promotorji */

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-11T21:21:23Z

Zala.kramar: /* Oblikovanje plazmidov */

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-11T21:15:28Z

Zala.kramar: /* Uvod */

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-11T21:10:12Z

Zala.kramar:

==Uvod==
==Oblikovanje plazmidov==
==Tumor specifični promotorji==
===Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT===
===Promotor gena BIRC5===
===Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)===
===Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1===
===Promotor za prostato specifičen antigen===
==Proizvodnja protiteles==
==Vnos plazmidov v celice==
==Viri==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-10T18:31:51Z

Zala.kramar:

==Naslov==
===Podnaslov===

Molekularna biologija plazmidov

2024-05-10T18:30:18Z

Zala.kramar:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2023/24 obravnavajo plazmide, ki jih sicer biokemiki poznamo predvsem kot vektorje v DNA-tehnologiji. Pregledali bomo njihovo klasifikacijo, načine podvojevanja in razporejanja v hčerinske celice, njihov prenos s konjugacijo, pomen pri širjenju odpornosti proti antibiotikom. Na koncu si bomo ogledali še nekaj primerov uporabe plazmidov na različnih biotehnoloških in medicinskih področjih. Okvirni naslovi tem so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato praviloma vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200–1800 besed), ki ste jih uporabili. Če izjemoma seminar pripravita dva študenta, je obseg povzetka 1000-1500 besed, če je študent sam, pa 800-1200 besed.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15–20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali, in vključite le malo splošnega uvoda, kjer je mogoče pa izpostavite ključne razlike v procesih med bakterijami, evkarionti in arhejami. Če seminar predstavljata dva študenta, imata na voljo 12-15 minut, če je študent sam, pa 8-10 minut.

Seminarske predstavitve bodo potekale med 24. aprilom in 15. majem 2024. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot sredini termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. ~10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim, tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].

Seznam tem in referenti:

24. april: 
# [[Klasifikacija plazmidov]] (Jan Hvalec, Tjaša Lešnik, Nika Makuc) 
# [[Replikacija plazmidov po mehanizmu téta]] (Nika Janc, Špela Puhov, Lara Ferjančič) 
# [[Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga]] (Tinkara Robek, Lara Pajnhart, Tina Kosovel) 

6. maj: 
# [[Interakcije plazmid - kromosom]] (Špela Longar, Tiara Pšeničnik, Anita Mulalić) 
# [[Razporejanje plazmidov v hčerinski celici]] (Karin Kunstelj, Brina Klinar, Nina Cankar) 
# [[Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami]] (Lana Bajec, Vid Kozel, Domen Trontelj)
# [[Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis]] (Mark Frantar, Simon Kristl, Andraž Snedec) 
# [[Modeli konjugacije med črevesnimi bakterijami]] (Peter Gričar Vintar, Maj Dular) 

8. maj: 
# [[Širjenje odpornosti proti antibiotikom med talnimi bakterijami]] (Uma Jordan Ferbežar, Debora Kociper, Dan Kolnik) 
# [[Vloga plazmidov v bakterijski evoluciji]] (Klara Kolenc, Veronika Trobiš, Teja Mohar) 
# [[Pomen plazmida Ti za patogenost agrobakterij]] (Katarina Gomiršek, Blaž Čerenak, Igor Osterc) 

13. maj: 
# [[Vloga plazmidov pri virulenčnosti klamidij]] (Nik Matek, Mark Varlamov, Anže Perc) 
# [[Kriptični plazmidi v človeških prebavilih]] (Nina Majerle, Jasna Čarman, Patricija Polutnik) 
# Vloga plazmidov pri kvarjenju piva, ki ga povzročajo mlečne bakterije
# [[Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev]] (Tonja Oman Sušnik, Zala Kramar, Anja Škarabot) 
# Plazmidni replikoni v farmacevtski industriji

15. maj: 
# Atipična sistema segregacije pri plazmidih z nizkim številom kopij

Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

2024-05-10T18:27:54Z

Zala.kramar: Created page with "==UVOD=="

==UVOD==

BIO2 Seminar 2023

2023-12-03T16:20:07Z

Zala.kramar: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
| Veler, Jakob Urh || 12 || || Ferjančič, Lara || Kolenc, Klara || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Majerle, Nina || 12 || || Perc, Anže || Škarabot, Anja || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Kokol, Anja || 12 || || Bernik, Miha || Čerenak, Blaž || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Trontelj, Domen || 12 || || Janc, Nika || Puhov, Špela || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Kozel, Vid || 12 || || Oman Sušnik, Tonja || Boštjančič, Ava || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Kunstelj, Karin || 14-15 || || Veler, Jakob Urh || Ferjančič, Lara || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Jordan Ferbežar, Uma || 14-15 || || Majerle, Nina || Perc, Anže || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Hvalec, Jan || 14-15 || || Kokol, Anja || Bernik, Miha || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Oman Sušnik, Tonja || 14-15 || || Trontelj, Domen || Janc, Nika || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Frantar, Mark || 14-15 || || Kozel, Vid || Oman Sušnik, Tonja || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Kostanjšek, Žan || 16 || || Kunstelj, Karin || Veler, Jakob Urh || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Makuc, Nika || 16 || || Jordan Ferbežar, Uma || Majerle, Nina || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Robek, Tinkara || 16 || || Hvalec, Jan || Kokol, Anja || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Klinar, Brina || 16 || || Bervar, Amber || Trontelj, Domen || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Bajec, Lana || 16 || || Frantar, Mark || Kozel, Vid || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Kociper, Debora || 17 || || Kostanjšek, Žan || Kunstelj, Karin || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Cankar, Nina || 17 || || Makuc, Nika || Jordan Ferbežar, Uma || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Žulič, Jošt || 17 || || Robek, Tinkara || Hvalec, Jan || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Bartol, Mojca || 17 || || Klinar, Brina || Bervar, Amber || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Ciglar, Nika || 17 || || Bajec, Lana || Frantar, Mark || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Bregar, Jana || 18 || || Kociper, Debora || Kostanjšek, Žan || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Kosovel, Tina || 18 || [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2023#Tina_Kosovel_-_Kako_aminokisline_podpirajo_na%C5%A1_imunski_sistem Kako aminokisline podpirajo naš imunski sistem] || Cankar, Nina || Makuc, Nika || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Dular, Maj || 18 || || Žulič, Jošt || Robek, Tinkara || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Matek, Nik || 18 || || Bartol, Mojca || Klinar, Brina || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Trobiš, Veronika || 18 || || Ciglar, Nika || Bajec, Lana || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Osterc, Igor || 19 || || Bregar, Jana || Kociper, Debora || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Kramar, Zala || 19 || [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2023#Zala_Kramar_-_Vloga_proteinov_dru%C5%BEine_Bcl-2_pri_intrinzi%C4%8Dni_poti_apoptoze Vloga proteinov družine Bcl-2 pri intrinzični poti apoptoze] || Kosovel, Tina || Cankar, Nina || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Kolnik, Dan || 19 || || Dular, Maj || Žulič, Jošt || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Lešnik, Tjaša || 19 || || Matek, Nik || Bregar, Jana || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Habot, Hanna || 19 || || Trobiš, Veronika || Ciglar, Nika || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Mulalić, Anita || 20 || || Osterc, Igor || Bartol, Mojca || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Gričar Vintar, Peter || 20 || || Kramar, Zala || Kosovel, Tina || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Pajnhart, Lara || 20 || || Kolnik, Dan || Dular, Maj || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Hudobivnik, Laura || 20 || || Lešnik, Tjaša || Matek, Nik || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Vogrič, Vanja || 20 || || Habot, Hanna || Trobiš, Veronika || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Pšeničnik, Tiara || 21 || || Mulalić, Anita || Osterc, Igor || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Snedec, Andraž || 21 || || Gričar Vintar, Peter || Kramar, Zala || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Polutnik, Patricija || 21 || || Pajnhart, Lara || Kolnik, Dan || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Longar, Špela || 21 || || Hudobivnik, Laura || Lešnik, Tjaša || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Kristl, Simon || 21 || || Vogrič, Vanja || Habot, Hanna || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Čarman, Jasna || 22 || || Pšeničnik, Tiara || Mulalić, Anita || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Kolenc, Klara || 22 || || Snedec, Andraž || Gričar Vintar, Peter || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Škarabot, Anja || 22 || || Polutnik, Patricija || Pajnhart, Lara || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Čerenak, Blaž || 22 || || Longar, Špela || Hudobivnik, Laura || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Puhov, Špela || 22 || || Kristl, Simon || Vogrič, Vanja || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Boštjančič, Ava || 23 || || Čarman, Jasna || Pšeničnik, Tiara || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Ferjančič, Lara || 23 || || Kolenc, Klara || Snedec, Andraž || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Perc, Anže || 23 || || Škarabot, Anja || Polutnik, Patricija || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Bernik, Miha || 23 || || Čerenak, Blaž || Longar, Špela || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Janc, Nika || 23 || || Puhov, Špela || Kristl, Simon || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Bervar, Amber || 23 || || Boštjančič, Ava || Čarman, Jasna || 15/01/2024 || 16/01/2024 || 17/01/2024
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim, da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo, in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [https://libgen.is/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2023|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. Pvzetek je tudi del pisnega izdelka.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5–12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli, v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva, določenega v tabeli, določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji. Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili, vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate, poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.docx za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.docx za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.docx za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.pptx za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje ... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2023

2023-12-03T16:16:21Z

Zala.kramar: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 =
==Anja Kokol - Pomen kompertmentalizirane signalizacije v membranskih raftih pri razvoju raka==
Raziskovanje lipidnih raftov, membranskih domen, bogatih s holesterolom in sfingolipidi, je izboljšalo razumevanje celične membrane pri signalni transdukciji. Te sortirne platforme igrajo ključno vlogo pri kompartmentalizaciji signalnih poti in s tem spodbujajo ali zavirajo preživetje, smrt in metastazo tumorskih celic. Transformirane celice vsebujejo višjo raven znotrajceličnega holesterola in s tem posledično več membranskih raftov. Rafti so, zraven prenosa signalov, pomembni za aktivacijo receptorjev, endocitozo, znotrajcelični promet in organizacijo z lipidi in proteini. V obliki lipidnih lupin zagotavljajo proteinom, ki so jih tako ločili od ostalih, primerno mikrookolje in s pomočjo takšnega mehanizma vklopijo ali izklopijo določene poti prenosa signala. Na celične procese pomembno vpliva asimetrija holesterola v plazemski membrani, ki se vzdržuje z aktivnim transportom holesterola iz notranjega v zunanji del. Zaradi prenosa signala po lipidnih raftih lahko pride do prekomerne ekspresije in aktivacije številnih poti in sistemov rastnih faktorjev, kar pripomore k razvoju tumorja. Eden od njih je tudi aktivator signalne poti PI3K/AKT, ki je pomemben udeleženec pri nastanku raka. Značilnost sesalskih celic je prisotnost receptorjev smrti na njihovi površini. Ti zagotavljajo sposobnost apoptoze. Ligandi receptorjev smrti sprožijo značilno signalizacijo preko oligomerizacije receptorjev, kar posledično povzroči rekrutiranje specializiranih adapterskih proteinov znotraj lipidnih raftov. S preučevanjem membranskih raftov se je rodil tudi koncept CASMER, s pomočjo katerega se je razvila nova ideja zdravljenja raka.

==Vid Kozel - Vloga onkogenov in tumor zavirajočih genov pri razvoju raka==
Onkogeni kodirajo okvarjene proteine ter s tem povzročajo tumorje. Nastanejo iz spremenjenih proto-onkogenov. Za naše zdravje so zelo nevarni, saj spodbujajo delovanje procesov, ki vodijo do raka. Aktivirajo se zaradi genetske spremembe proto-onkogenov, najpogosteje do tega pride zaradi točkovnih mutacij; mutacije z večjo funkcionalnostjo, kromosomske translokacije, virusna integracija, epigenetske spremembe, spremembe regulatornih proteinov. Tumor zavirajoči geni ali tumorski supresorji tvorijo regulatorne proteine, ki preprečujejo delitev rakavih celic ter spodbujajo popravljanje DNA. Aktivirajo se s transkripcijsko aktivacijo, posttranslacijskimi modifikacijami ali interakcijami med proteini. Njihova glavna naloga je vzdrževanje genoma, prav tako pa preprečujejo nenadzorovano rast celic.
Pot RAS-RAF-MEK-ERK je signalna pot onkogenov, ki ima vlogo pri rasti, delitvi, preživetju in diferenciaciji celic. Njena nenormalna aktivacija lahko povzroči nastanek tumorjev. Pot se začne z aktivacijo RAS, do katere pride zaradi zunajceličnih signalov. RAS potem aktivira še RAF in sproži kaskado fosforilacije. Nato se aktivira MEK, ki sproži dvojno fosforilacijo in aktivira ERK, aktivacija le-te pa vodi do razmnoževanja, preživetja ali diferenciacije celic.
TP53 je gen, ki kodira tumor supresorski protein p53, ta pa zatira tumorje. Na poškodbe DNA odgovarja tako, da ustavi celični cikel ter nato popravi DNA, sproži apoptozo ali pa senescenco. Njegovo delovanje inhibira MDM2, ki ga lahko dodatno stabilizira MDM4. Ob mutacijah na TP53, ter posledično na P53, ta izgubi sposobnost obrambe proti tumorjem.
Z ugotavljanjem mutacij onkogenov/tumorskih supresorjev, ali s tem da ti služijo kot biomarkerji, lahko zdravniki napovejo verjetno napredovanje raka ter izberejo ustrezno zdravljenje.

==Nina Majerle - Z G-proteini sklopljeni vzorčno prepoznavni receptorji izraženi v nevtrofilcih==
Nevtrofilci so najpogostejši levkociti v človeški krvi in so ključnega pomena za pravilno delovanje imunskega sistema. Na površini izražajo različne receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce tipične za patogene organizme in za poškodovane gostiteljske celice. Ti receptorji so ključnega pomena za delovanje nevtrofilcev, saj jim omogočajo regulacijo vnetnega odziva, diferenciacijo, priklic drugih celic imunskega sistema in fagocitozo. Mnogi od teh receptorjev pripadajo družini z G-proteini sklopljenih receptorjev. GPCR-ji imajo značilno strukturo sedmih α-vijačnic, prenos signala prek GPCR-jev pa največkrat poteka preko heterotrimernih G-proteinov. Seminarska naloga obravnava tako splošne značilnosti GPCR-jev, kot tudi podrobneje opiše mehanizme delovanja in funkcije nekaterih bolj znanih GPCR-jev izraženih na membranah nevtrofilcev, ki delujejo po principu vzorčnega prepoznavanja: družina formil peptidnih receptorjev (FPRs), purinergični receptor P2Y2R in dva člana družine receptorjev prostih maščobnih kislin FFA2R in GPR84. Poleg tega prek relevantnih primerov razlaga nekatere ključne pojme in koncepte v biokemiji kot so ortosterično vezavno mesto, alosterični receptorski modulatorji, vzorčno prepoznavanje, homologna in heterologna desenzibilizacija, receptorska transaktivacija, funkcionalna selektivnost in pa tudi pojme, ki se nanašajo na same nevtrofilce kot sta kemotaksija in primiranje. Na koncu se seminarska naloga naveže še na uporabnost poznavanja strukture in delovanja GPCR-jev izraženih v nevtrofilcih pri zdravljenju različnih imunskih obolenj.

==Jakob Urh Veler - Gvanilil ciklaze kot ključni receptorji in encimi pri celični biosignalizaciji==
Družina proteinov gvanilat ciklaze/gvanilil ciklaze (GC) v svoji katalitični domeni ciklizirajo GTP v cGMP. Ciklični GMP je sekundarni sporočevalec. Z nadaljno kaskado vpliva na protein kinaze (cGK), fosfodiesteraze (PDE) in ionske kanalčke (CNG). So pomembne za pravilno delovanje več organskih sistemov. Glede na strukturne, funkcionalne in regulatorne značilnosti GC delimo na membranske (mGC/pGC) in topne (sGC) oblike. Poznamo tipične in atipične sGC. Po priporočeni nomenklaturi poznamo 7 tipov mGC: MG-A, MG-B, MG-C, MG-D, MG-E, MG-F in MG-G. Vlogo encima in receptorja opravljajo topne gvanilil ciklaze v citosolu in membranske na celični membrani. Aktivirane so lahko tudi z endogenim NO, O2, HCO3-, natriuretskimi hormoni in s Ca2+-vezanimi proteini. V nadaljevanju podrobneje opisana aktivacija sGC z NO ter aktivacija GC-A z atrijskim natriuretskim hormonom (ANF). Z manipulacijo genov za zapis gvanilil ciklaz so odkrili njihove vloge v celicah in pomen specifičnih domen. Z različno stopnjo izražanja izoencimov je v celicah visoka diverziteta GC, zato je to mrežo signalizacije brez in vivo opazovanja zahtevno raziskovati. Približno 60 let že raziskujejo gvanilil ciklaze. Razumevanje te signalne poti je ključnega pomena za zdravljenje določenih bolezenskih stanj, saj imajo zdravila več tarčnih mest za delovanje.

==Domen Trontelj - G protein sklopljeni receptorji v fiziologiji okusa in farmakologiji==
G protein sklopljeni receptorji (GPCR), predstavljajo največjo družino receptorjev pri sesalcih in so ključni za uravnavanje večine fizioloških funkcij. Poleg posredovanja pri zaznavi vonja in vida, so prav tako prenašalci signala treh osnovnih okusov- sladko, umami in grenko, prav tako pa so ključnega pomena pri zaznavanju okusa kokumi. Nahajajo se v specializiranih okuševalnih celicah (TRC) znotraj brbončic. Tip I okuševalnih GPCR-jev (TAS1R) so heterodimerni kompleksi, ki skužijo kot receptorji za sladko (TAS1R2/TAS1R3) ali umami (TAS1R1/TAS1R3) okus, medtem ko Tip II obsega monomerne receptorje za grenak okus ali pa kokumi/kalcijeve receptorje.
Receptorji za sladko, umami in kokumi delijo strukturne podobnosti, saj vsebujejo več mest za vezavo agonistov z izrazito selektivnostjo, medtem ko večina grenkih receptorjev vsebuje le eno vezavno mesto, ki neselektivno sprejme veliko različnih ligandov. Vezava agonistov na receptor aktivira sekundarnih prenašalce, kar privede do vdora kalcija, to vodi do depolarizacije celice in na koncu sprostitve nevrotransmiterja.
Kljub nedavnim napredkom na področju raziskav konformacijskih sprememb, potrebnih za aktivacijo receptorja, ostaja še veliko nerešenih. V zadnjih letih so različni pristopi, ki združujejo heterologno izražanje, mutagenezo, homologno modeliranje in knockout študije na miših, skupaj ponudili vpogled v strukturo in pozicijo vezavnih mest za ligande in mehanizme ortosterične in alosterične modulacije.

==Karin Kunstelj - Potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije najdene prav v metabolizmu celic kostnega mozga in njegovega mikrookolja==
Izogibanje detekciji in odgovoru imunskega odziva sodi med glavne težave levkemije poleg neuspešne imunoterapije. Burne poti mikrookolja so v ozadju odgovora tako rakavih kot zdravil celic, problem pa se pojavi, ko rakave celice prevzamejo vodilno vlogo metabolizmov in nadzorujejo reakcije sebi v prid. Mednje spadata tudi produkcija energije in izogibanje detekciji in pa odgovoru imunskih celic. Novo možnost terapije bi potemtakem lahko predstavljalo ciljanje povezav med mikrookoljem kostnega mozga in levkemičnimi celicami. V seminarju je podrobno opisano mikrookolje kostnega mozga, pomembne metabolične poti ogljikovih hidratov, aminokislin in maščobnih kislin. Opisani so tudi procesi levkemičnih celic, ki zdravljenju povzročajo težave in neuspešnost. Prav tako opozori na nove potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije. Svoj fokus orientirajo in najdejo prav v mikrookolju kostnega mozga in problematičnih levkemičnih celic. Metabolizem levkemičnih celic, ki povzroča obolenja in preglavice tako obrne v svoj prid. Na koncu pa še poudari na pomembnost dodatnih raziskav in študij zaradi nedovršenih, premalo eksaktnih in pa preveč nasprotujočih-si rezultatov.

==Tonja Oman Sušnik - Metabolizem glukoze, senescenca živčnih celic in Alzheimerjeva bolezen==
Alzheimerjeva bolezen je nevrodegenerativna bolezen z visoko pojavnostjo predvsem med starejšimi. Pri njej sčasoma pride do upada miselnih sposobnosti in razvoja drugih psiholoških motenj. Njen razvoj je sicer že precej dobro raziskan, a zdravila, ki bi v celoti odpravil škodo storjeno na možganih, še ne poznamo. Tekom same bolezni se prepleta mnogo simptomov, ki so odvisni eden od drugega. To so med drugimi inzulinska rezistenca, celična senescenca, nevroinflamacija, nalaganje proteinskih plakov in oslabljen metabolizem glukoze. Najpomembnejša pri tem je celična senescenca, ki je v močni povezavi s staranjem. Ta napade tako živčne celice kot tudi glialne celice in povzroči nalaganje proteinov ter oslabljeno energijsko proizvodnjo celice. Slabša energetska preskrbljenost, kar je za nevrone izredno nevarno in se odraža v njihovem slabšem delovanju ter zmanjšani sinaptični plastičnosti, pa je tudi posledica zmanjšanega prevzema glukoze. Z boleznijo se število glukoznih transporterjev zmanjšuje, veča pa se inzulinska rezistenca. Nevroni zato ne sprejmejo dovolj glukoze za proizvodnjo ATP. Kako bi samo znanje o teh fizioloških okvarah prenesli na zdravljenje, še ni znano, a na to temo poteka mnogo tekočih raziskav. Najbolj ugodno bi bilo odstranjevanje senescentih celic, neposredno targetiranje glukoznega metabolizma ali razbijanje proteinskih plakov. Pozitivne rezultate dajejo tudi raziskave, kjer so opazovali odzivnost metabolizma glukoze na srednje intenzivno vadbo. Ta se je že pri enkrat tedenski vadbi močno izboljšal, napredovanje bolezni pa skoraj popolnoma zaustavilo.

==Jan Hvalec - Uravnavanje metabolizma endotelijskih in imunskih celic==
Endotelijske celice gradijo notranjo površino žil. Njihova funkcija je tesno povezana z ohranjanjem homeostaze tkiv, regulacijo krvnega pretoka in angiogeneze. Za opravljanje svoje naloge imajo prilagojen metabolizem z znižano stopnjo oksidativne fosforilacije in pospešeno glikolizo. Angiogeneza temelji na kolektivni migraciji endotelijskih celic, pri čemer konične celice usmerjajo poganjek, medtem ko ga stebelne celice podaljšujejo s proliferacijo. Rast žil se začne z razgradnjo bazalne membrane in izbiro konične celice pod vplivom vaskularnega endotelijskega faktorja (VEGF) in inducibilnega faktorja hipoksije (HIF), ki ju sproščajo telesne celice v hipoksičnih pogojih. Vlogo konične celice prevzame celica s hitrejšo energetsko proizvodnjo. Ker VEGF in HIF pospešita izražanje encima PFKFB3, ki pospešuje glikolizo, so ravni PFKFB3 višje v konici kot v steblu poganjka. Druga vrsta celic, ki glede na diferenciacijo prilagodi svoj metabolizem, so celice imunskega sistema. T-celice pomagalke in citotoksične celice se zanašajo na glikolizo in presnovo glutamina za tvorbo potrebne količine energije. Medtem ko se M1 makrofagi tudi zanašajo na glikolizo, je vloga metabolne poti drugačna, saj jo prednostno uporabljajo za vzdrževanje polnega stanja delovanja (razgradnjo fagocitiranih delcev). Nasprotno se spominske in regulatorne T-celice zanašajo na oksidacijo maščobnih kislin za učinkovitejšo proizvodnjo ATP, oksidativno fosforilacijo pa uporabljajo za vzdrževanje učinkovitega dolgoročnega delovanja.

==Mark Frantar - Energetika možganov in nevrodegenerativne bolezni==
Možgani so zaradi številnih funkcij, kot so vzdrževanje membranskega potenciala, recikliranje živčnih prenašalcev ter prenašanje signalov, energijsko izjemno zahteven organ. Za delovanje stalno potrebujejo energijo v obliki ATP, ki jo večinoma dobijo iz glukoze z oksidativno fosforilacijo, nekaj pa iz aerobne glikolize v citoplazmi. Za dostavljanje virov energije do nevronov skrbi nevrovaskularna enota, sestavljena iz endotelijskih celic kapilar, astrocitov ter nevronov. Nevroni lahko za vir energije uporabijo tudi ketone ali laktat, ki se proizvede v astrocitih s pretvorbo piruvata z laktat dehidrogenazo, nato pa je transportiran v nevrone skozi monokarboksilatne transporterje (MCT). Pri nevrodegenerativnih boleznih (NDB) pride do okvare metabolizma v možganih, najpogosteje do hipometabolizma glukoze. To vodi v stalno pomanjkanje energije, ki povzroči propad nevronskih celic, nabiranje agregatov nevrotoksičnih proteinov in disfunkcijo mitohondrijev, to pa še nadaljnje okvari metabolizem. Za upočasnjevanje napredovanja NDB obstaha več terapij in zdravil, a jih večina še ni dovolj testirana. Zdravila podpirajo mitohondrijske funkcije, izboljšujejo inzulinsko senzitivnost, zmanjšujejo inflamacijo, ipd. Uporabljajo se tudi ketonski prehranski dodatki ali ketogena dieta, saj gre pri NDB lahko le za okvaro metabolizma glukoze, medtem ko je metabolizem ketonov normalen. Optimizacija energetike možganov je torej temeljnega pomena pri NDB in bi morala biti prvi korak pri poskusih zakasnitve pojava in napredovanja NDB.

==Uma Jordan Ferbežar - Mnogi obrazi piruvat kinaze M2: Poudarek na vlogi pri vnetnih procesih==
Piruvat kinaza je encim, ki katalizira zadnji korak glikolize, v katerem nastaneta ATP in piruvat. Obstaja v štirih različnih izoformih, ki se nahajajo v različnih tkivih, vsi pa imajo katalitično vlogo. Izoform PKM2 je edini, ki se pojavlja v različnih konformacijah, in sicer dveh tetramernih (aktivna R-oblika in neaktivna T-oblika) ter dimerni in monomerni. Prehod med tetramerno in dimerno obliko je izjemno dinamičen in odvisen od okoliščin ter potreb celice, nadzorujejo pa ga številni regulatorji. Aktivna tetramerna oblika sodeluje v glikolizi, medtem ko ima dimerna oblika drugačne vloge - lahko se, na primer, premakne v jedro, kjer nadzoruje izražanje genov ter regulacijo različnih prepisovalnih faktorjev. Dimerno obliko opazimo tudi pri rakavih in imunskih celicah, kjer sodeluje pri spremembi metabolizma iz oksidativne fosforilacije v aerobno glikolizo, kar celicam ob povečani porabi glukoze omogoča zadostno količino ATP ter prekurzorjev za sintezo potrebnih makromolekul, kot so lipidi in proteini. PKM2 v povečanih količinah najdemo pri bolnikih z različnimi vnetnimi obolenji, kot je na primer revmatoidni artritis. Deluje tako na celice prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, in sicer predvsem s povečevanjem količine proinflamatornih citokinov preko uravnavanja njihovega izražanja, sodeluje pa tudi pri diferenciaciji T celic in njihovi komunikaciji. Zaradi številnih načinov regulacije predstavlja dobro tarčo za zdravljenje vnetnih obolenj.

==Tinkara Robek - Signalizacija cikla: Intermediati cikla citronske kisline v vlogi miometabokinov==
Cikel citronske kisline predstavlja temelj katabolnih procesov za pridobivanje energetsko bogatih molekul v sklopu metabolizma v živih bitjih. Je ključen korak pri predelavi z ogljikom bogatih spojin pri pridobivanju ATP-molekul. Intermediati cikla so poleg členov cikla in izhodnih spojin za sintezo drugih biološko pomembnih molekul tudi pomembne signalne molekule. Med drugim spadajo med miometabokine; majhne molekule iz skupine citokinov, ki jih izločajo miocite in regulirajo komunikacijo med različnimi tipi tkiv. V večji meri se iz mišičnh celic izločajo v krvni obtok v akutni fazi intenzivnejše fizične aktivnosti in nato opravljajo specifične signalne funkcije v različnih tkivih in s tem vplivajo na potek vnetnih procesov v organizmu in izražanje proteinov. Njihovo funkcionalnost se lahko opredeli kot avtokrino, endokrino in parakrino. Delujejo s pomočjo njim specifičnim transporterjev in se po opravljeni nalogi v večini transportirajo po krvnem obtoku do jeter, kjer se razgradijo. Do sedaj je bilo odkritih in raziskanih največ funkcij citrata in sukcinata, v ospredje pa stopa tudi alfa ketoglutarat, predvsem s svojimi antioksidativnimi učinki. Obsegajo relativno novo področje fiziologije, zaradi česar je potrebno nadaljevati z raziskovanjem značilnosti in vplivov teh molekul za potrditev domnev.

==Nika Makuc - Glutamat-oksaloacetat transaminaza kot terapevtska tarča za zdravljenje ishemične možganske kapi==
Ishemična možganska kap predstavlja večino primerov možganske kapi, do katere pride zaradi zapore krvnih žil. Metode zdravljenja ishemične možganske kapi vključujejo trombolitično zdravljenje, ki pa se uporablja v omejenem obsegu in le pri manj kot 10 % vseh bolnikov z možgansko kapjo. Glutamat je aminokislina, ki ima v osrednjem živčevju funkcijo najpogostejšega vzdražnega nevrotransmiterja, v patoloških razmerah pa deluje kot močan nevrotoksin. Povišan zunajcelični glutamat ima osrednjo vlogo pri poškodbah možganov, do katerih pride zaradi ishemične možganske kapi. Novo terapevtsko tarčo pri zaščiti pred to vrsto poškodb pa predstavlja encim glutamat-oksaloacetat transaminaza (GOT), ki med ishemično možgansko kapjo zniža raven glutamata na mestu kapi. Pri presnovi glutamata s pomočjo GOT v možganskem tkivu nastajajo tudi vmesni produkti cikla citronske kisline. GOT torej lahko med ishemično možgansko kapjo omogoči, da se sicer ekscitotoksični glutamat pretvori v življenjsko pomembne vmesne produkte cikla citronske kisline. Opravljenih je bilo že več študij, ki so se osredotočale na zaščito nevronov z zmanjšanjem glutamata pri ishemični kapi, a so bile v praksi neuspešne. Sistemsko dajanje oksaloacetata predstavlja novo strategijo za zmanjšanje škodljivega učinka glutamata v možganskem tkivu po ishemični kapi. Učinek oksaloacetata namreč temelji predvsem na sposobnosti te molekule, da zmanjša raven glutamata v možganih in krvi zaradi aktivacije encima GOT.

==Brina Klinar - Vloga citrat transportnega proteina in citrata v celičnih procesih==
Citrat transportni protein (CTP) je transportni protein družine transmembranskih prenašalcev SCL25, ki se nahaja v notranji membrani mitohondrija. Njegova primarna vloga je import citrata v mitohondij ali eksport v citosol. Ustrezna aktivnost in pravilno CTP je ključnega pomena za optimalno delovanje celice. Ustrezne količine citrata v citosolu in mitohondriju so namreč pomembne za produkcijo energije, sintezo acetil-CoA kot prekurzorja biosinteze horesterola in maščobnih kislin in kot donorja acetilne skupine za actilacijske reakcije posttranslacijskih in epigenetskih modifikacij, vnetne procese in celično regulacijo. Za ohranjanje homeostaze citrata v citosolu obstajajo tudi alternativne poti, neodvisne od CTP, npr. prevzem ekstracelularnega citrata v celico prek plazmalemskih citratnih transporterjev. Kljub temu, se izguba CTP z mutacijami kaže v hudih napakah zgodnjega možganskega razvoja, kot sta npr. DiGeorgejev sindrom in L-2/D-2-hidroksiglutarna aciduria, kar nakazuje na velik pomen tega transportnega proteina. Po drugi strani pa ima inhibicija CTP inducirana s sintetičnimi inhibitorji CTP obetavno prihodnost na področju zdravljenja raka in presnovnega sindroma.

==Lana Bajec - Metabolni inženiring cikla citronske kisline za produkcijo kemikalij==
Izčrpanost fosilnih virov energije na zemlji, ki jo spremlja njihov vpliv na okolje, dviguje povpraševanje po zamenjavi kemikalij na osnovi nafte z boljšimi alternativami, prijaznejšimi do okolja. Skozi leta so se razvile različne strategije pridobivanja teh kemikalij s pomočjo fermentacijskih produktov različnih mikroorganizmov. Krebsov cikel ali cikel citronske kisline je eden pomembnejših procesov v celici in se že desetletja uporablja v metabolnem inženiringu, največ v produkciji spojin kot so L-glutamat, citrat in sukcinat. Žal je izkoristek pridobivanja teh produktov skozi Krebsov cikel slab, zato se je razvil nov način, ki privede do boljšega izkoristka. Uporaba povratnega Krebsovega cikla, ki ga določeni organizmi vršijo v anaerobnih pogojih. Za ta proces je značilna proizvodnja ogljikovih spojin iz ogljikovega dioksida in vode. Kemijske reakcije, ki se vršijo, pa so obtratne tistim, ki jih vidimo v Krebsovem ciklu. Ker se pri tem procesu porablja CO2, pa to poleg še vpliva na zmanjševanje CO2 emisij. Pri proizvodnji sukcinata pa so z določenimi pogoji mikroorganizme pripravili do tega, da poleg povratnega Krebsovega cikla, vršijo še glikosilatni cikel. Ta je sklop anaplerotičnih reakcij, ki vir ogljika, s porabo CO2, spreminja v sukcinat.

==Nina Cankar - Vpliv oksidacije maščobnih kislin na delovanje in diferenciacijo limfocitov T==
Limfociti T so celice imunskega sistema in so sposobni prehajati med visoko aktivnim anabolizmom in mirujočim katabolizmom, ki temelji na mitohondrijski oksidaciji maščobnih kislin. FAO je aktivna pri naivnih, regulatornih in spominskih limfocitih T ter močno zmanjšana pri efektorskih limfocitih T. Ob aktivaciji naivnih T celic pride do prehoda iz katabolizma z aktivno FAO na anabolizem in aerobno glikolizo, ki zadosti povečanim energijskim potrebam limfocitov T. Prehod regulirajo PI3K-Akt-mTOR signalna pot ter SREBP proteini. CD4+ efektorski limfociti T s pomočjo PPARγ ohranijo prevzem in oksidacijo maščobnih kislin, kar pa ne velja za CD8+ celice. Od obeh vej odstopajo regulatorni limfociti T, ki večino energije pridobijo s FAO. Ob koncu okužbe večina efektorskih limfocitov T preide v apoptozo, majhen delež pa se diferencira v spominske celice. Tem oksidacija maščobnih kislin, sklopljena z oksidativno fosforilacijo, omogoča dolgo življenjsko dobo in hkrati sposobnost hitrega odziva na ponovno okužbo z istim patogenom. Pri diferenciaciji v spominske limfocite T sodeluje TRAF6, spodbujajo pa jo tudi ostale signalne poti, ki aktivirajo katabolizem ter spodbujajo mitohondrije in izražanje CPT1A. Inhibicija oksidativne fosforilacije v spominskih limfocitih T ovira njihovo tvorbo, aktivacijo in proliferacijo. Poznavanje mehanizmov regulacije FAO v limfocitih T omogoča razvoj novih terapij za bolnike z avtoimunskimi in vnetnimi boleznimi.

==Nika Ciglar – Variabilnost izgube teže z zaviralci SGLT2 in agonisti receptorjev GLP-1 pri sladkorni bolezni tipa 2 in debelosti==
V današnjem času se vse več ljudi spopada z velikim problemom in to je debelost. Povišana telesna teža ni le problem premajhne fizične vadbe in prevelikih količin energetsko bogate hrane, temveč je lahko posledica ali pa tudi vzrok bolezni. Ena izmed teh bolezni je sladkorna bolezen tipa 2. Starejša zdravila za zniževanje ravni glukoze pri sladkornih bolnikih so povzročala povečanja telesne mase, novejša zdravila pa vplivajo na telo z ravno nasprotnim učinkom. To seveda ne velja za vse bolnike. Na podlagi teh podatkov so znanstveniki začeli ugotavljati ali bi lahko razvili zdravilo proti debelosti. Hoteli so ustvariti zdravilo, kjer ni izguba telesne teže le eden od stranskih učinkov temveč glavna tarča delovanja učinkovine. Med najnovejšimi razredi zdravil sta zaviralec natrijevega glukoznega koprenašalca 2 (SGLT2) in agonist glukagonu podobnih peptidnih receptorjev (GLP-1).

==Debora Kociper - FAT (CD36/SR-B2) v povezavi z metabolizmom maščobnih kislin v skeletnih mišicah==
Vnos maščobnih kislin v celico skeletnih mišic je skrbno reguliran proces, pri katerem sodelujejo tri glavne skupine proteinov – FABP, FATP in FAT (CD36/SR-B2). Vsi lajšajo prenos maščobnih kislin v celico, CD36/SR-B2 pa ima vlogo tudi v sami regulaciji transporta. Regulacija vstopa maščobnih kislin v celico s CD36/SR-B2 je regulirana kratkoročno in dolgoročno. Kratkoročno je regulirana z intracelularnim recikliranjem tega proteina. Glavna dejavnika, ki vplivata na kratkoročno regulacijo sta telesna aktivnost in inzulin. Pri dolgoročni regulaciji sodelujejo receptorji PPAR. Maščobne kisline delujejo kot naravni ligand teh receptorjev. Aktivacija receptorjev PPAR sproži prepisovanje določenih genov in proteinov, ki sodelujejo pri transportu maščobnih kislin čez celično membrano, med drugim CD36/SR-B2.
Pri povišani dostopnosti maščobnih kislin pride do razlik v odgovoru pri zdravih posameznikih in posameznikih z debelostjo. Raziskovanje delovanja CD36/SR-B2 predstavlja potencialne možnosti pri reševanju problema debelosti. CD36/SR-B2 igra pomembno vlogo tudi pri inzulinski rezistenci. Telesna aktivnost v vseh primerih pozitivno vpliva na zmožnost oksidacije maščobnih kislin.

==Tina Kosovel - Kako aminokisline podpirajo naš imunski sistem==
Aminokisline igrajo zelo pomembno vlogo v aktivaciji in samem delovanju naših imunskih celic. Njihov vnos in količina v celici strogo nadzorujeta delovanje celičnih presnovnih poti (TCA, glikoliza, oksidativna fosforilacija). Glutamin preko pretvorbe v glutamat priskrbi α-ketoglutarat, ki vstopi v TCA cikel. Razvejane aminokisline povečajo število glukoznih transporterjev in tako podpirajo glikolizo. Poleg tega za TCA zagotavljajo α-ketoglutarat ter derivate CoA. Serin alosterično aktivira encim, ki poskrbi za tvorbo piruvata in poveča translacijo proteinov v mitohondriju, vključno s tistimi, ki so del elektronske prenašalne verige. Poleg tega so aminokisline odgovorne za ohranjanje redoks homeostaze v celici in priskrbijo ključne snovi za njeno delovanje. Metionin in serin poskrbita za tvorbo cisteina, ki služi kot vir žvepla za tvorbo FeS klastrov. Te uporablja veliko encimov. Poleg tega je žveplo potrebno tudi za tiolacijo tRNA, kar pomaga pri translaciji. Cistein, glutamin in glicin tvorijo glutation, ki veže reaktivne kisikove radikale in tako skrbi za redoks homeostazo v celici. Te procese so mnogi virusi in tumorji sposobni izkoristiti, da imunske celice onesposobijo ali pa se izognejo njihovi detekciji. Hkrati pa nam ti aminokislinski mehanizmi nudijo veliko področje potencjalnih strategij za nova zdravila.

==Maj Dular - Zdravljenje raka z deprivacijo arginina==
Arginin je pol-esencialna aminokislina, ki ima ključno vlogo pri biosintezi beljakovin. Lahko se pridobi s dnevnim vnosom hrane ali sintetizira v telesu preko cikla uree, pri čemer se uporablja L-citrulin kot substrat. Arginin ima v telesu raznovrstno vlogo, saj prispeva k delitvi celic, zdravljenju ran, odstranjevanju amonijaka, delovanju imunskega sistema ter biosintezi hormonov. Predstavil bom razne tehnike. V primeru rakavih celic se sinteza svojega arginina izkaže za nezadostno, da bi zadostila njihovim povečanim prehranskim potrebam, kar jih sili v odvisnost od zunanjih virov arginina. V članku obravnavajo pomen odvzema arginina kot nov terapevtski pristop, predstavi različne metode, ki omogočajo odvzem arginina, ter njihove specifične mehanizme delovanja. Poleg tega osredotoča na dejavnike, ki vplivajo na migracijo celic, skupaj z raziskovanjem vpliva arginina na metastazo rakavih celic, predvsem preko poliaminov in dušikovega oksida (NO). Da bi dosegli proti rakave učinke , so razvili modificirane encime za razgradnjo arginina, kot sta PEGilirana rekombinantna humana arginaza 1 (rhArg1-PEG) in arginin deiminaza (ADI-PEG 20), ki so se v kliničnih preskušanjih izkazali za varne in učinkovite. Preizkušali so jih kot monoterapijo ali v kombinaciji z drugimi obstoječimi terapijami.

==Veronika Trobiš - BCAA in občutljivost na inzulin==
Razvejane aminokisline (BCAA) , med katere spadajo levcin, valin in izolevcin, so močni regulatorji sintetičnih in kataboličnih procesov v celicah sesalcev ter so posebej znane po spodbujanju sinteze beljakovin, zaradi česar so v obliki prehranskih dopolnil priljubljene med športniki. Pripomorejo k mišični rasti in pomagajo pri regeneraciji. Iz raziskav je razvidno, da so učinki BCAA pretežno odvisni od eksperimentalnega modela, vrste tkiva in energijskega ravnovesja. V pogojih pomanjkanja energije ali homeostaze, BCAA ( še posebej levcin) spodbujajo izboljšane metabolne poti, vključno z izboljšano absorpcijo glukoze/insulinsko občutljivostjo, povečano vsebnostjo mitohondrijev in ohranjanjem mišic. V pogojih kroničnega presežka energije pa celice, še posebej maščobne celice, izgubijo sposobnost razgrajevanja BCAA, kar povzroči kopičenje BCAA in povezanih metabolitov tako znotraj celice kot v krvnem obtoku. Enako pa povzročajo metabolne bolezni in inhibicija nekaterih metaboličnih regulatorjev, kot sta PGC-1α in PPAR. Zato so te aminokisline in njihovi metaboliti močni biomarkerji srčno-metaboličnih bolezni, vključno z debelostjo, diabetesom tipa 2 (T2D) in koronarno arterijsko boleznijo. Glede na študije iz zdravih populacij in športnikov, prehranski viri BCAA verjetno sami po sebi niso zadostni za povzročanje presnovnih bolezni pri sicer zdravih populacijah.

==Nik Matek - Homocistinurija, ki jo povzroča pomanjkanje cistionin β-sintaze==
Homocistinurija je avtosomalna recesivna dedna bolezen, kar pomeni, da pride do okvare na avtosomu. Bolezen je dokaj redka, vendar je njena pogostost geografsko odvisna. Zaradi okvare gena za zapis cistationin β-sintaze pride do prekomernega kopičenja homocistieina v krvni plazmi. Tem pojavu rečemo hiperhomocisteinemija. Ko so koncentracije dovolj velike, se začne homocistein kopičiti tudi v urinu. V tem primeru govorimo o homocistinuriji. Pogosti simptomi so ektopija oči, daljše okončine, nagnjenost k osteoporozi, težave z učenjem in tromboza, ki pogosto vodi v smrt. Homocistein je homolog cisteina, pogojno esencialne aminokisline s tiolno skupino. Nadpovprečne koncentracije homocisteina v krvi so povezane z različnimi duševnimi boleznimi. Homocistein telo proizvede iz metionina v procesu metilacije. Ta se lahko tudi remetilira nazaj v metionin ali pa vstopi v proces transulfuracijske poti, kjer se pretvori v cistein. Cistein β-sintaza sodeluje v prvem delu transulfuracijske poti, kjer homocistein pretvori v cistationin. V drugem delu se cistationin pretvori v cistein s pomočjo drugega encima transulforacijske poti, cistationin γ-liaze. Cistationin β-sintaza in cistationin γ-liaza sta oba odvisna od koencima PLP (aktivne oblike vitamina B6). Cistationin β-sintaza je prisotna tudi v procesih pridobivanja vodikovega sulfida, ki pa se pri homocistonuriji občutno zmanjšajo.

==Jana Bregar - Vpliv črevesne mikrobiote na metabolizem triptofana pri fenilketonuriji==
PKU (fenilketonurija) je redka dedna presnovna bolezen, ki prizadene sposobnost telesa za ustrezno metaboliziranje aminokisline Phe (fenilanin). To povzroča kopičenje Phe (fenilalanin) v krvi in možganih. Prehrana z nizko vsebnostjo Phe je ključna za obvladovanje PKU, zato se morajo bolniki s PKU doživljenjsko držati prehrane z nizko vsebnostjo Phe in prejemajo dodatno medicinsko prehrano, da dobijo dovolj esencialnih hranil. Povečana količina Phe ovira metabolizem drugih aminokislin, kot je Trp (triptofan). Trp (tirptofan) ima dve pomembnejši metabolni poti. To sta sinteza 5-HT (seratonin) in KYN (kinurenin) metabolna pot. 5-HT (serotonin) je nevrotransmiter, ki ima vlogo pri reguliranju razpoloženja in drugih nevroloških funkcij. Eden od produktov KYN (kinurenin) metabolne poti je QUIN (kinolinska kislina), ki je potencialno nevrotoksična spoijina. Črevesna mikrobiota tudi vpliva na metabolizem Trp in posledično na nevrološke simptome pri bolnikih s PKU. Spremembe v črevesni mikrobioti pri bolnikih s PKU lahko močno vplivajo na metabolizem dopamina in seratonina, saj se lahko Trp prednosto metabolizira po KYN poti namesto pretvori v seratonin. Zato je pomembno razumeti povezavo med črevesno mikrobioto in metabolizmom Trp pri bolnikih s PKU. Razumevanje vpliva PKU na metabolizem drugih aminokislin poleg Phe, omogoča razvijanje novih oblik zdravljenja PKU.

==Tjaša Lešnik - Vloga napak mitohondrijske DNA pri nevrodegenerativnih boleznih in staranju==
Mitohondriji so poleg jedra edini celični organeli z lastno DNA (mtDNA). Njihova primarna naloga je proizvodnja energije za delovanje celice in s tem organizma. V mitohondrijski DNA lahko prihaja tudi do napak, med katerimi so najpogostejše točaskte mutacije, delecije in prelomi vijačnice. V celici so se zaradi tega razvili nekateri popravljalni mehanizmi in ragulatorne poti, med njimi na primer BER – popravljanje z izrezom baze, MMR – popravljanje neujemanja in DSBR – popravljanje preloma dvojne vijačnice, ki uravnavajo nivo mutiranega dednega materiala. Kopičenje mutacij mtDNA naj bi z leti povrzočalo proces staranja, o katerem v povezavi z mitohondriji obstaja veliko teorij. Med njimi je najbolj znana t.i. teorija staranja zaradi prostih radikalov, ki predpostavlja, da mitohondrijski prosti radikali, ki nastanejo kot stranski produkt celičnega metabolizma, povzročajo napake na mtDNA, te pa nato staranje. Znano je tudi, da z leti nastaja vse več in več nevrodegenerativnih bolezni, ki so posledica postopnega odmiranja celic živčnega sistema. Najpogostejši sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen, ki so ju proučevali tudi iz vidika napak na mtDNA. Tako teorije o tem zakaj se staramo, kot povezava mitohondrijev z boleznimi, še zmeraj niso dovolj raziskane, kar predstavlja priložnost za mnoga nova odkritja in dognanja.

==Hanna Habot - Mitohondrijske kriste: kjer se lepota sreča s funkcionalnostjo==
Notranja membrana mitohondrija je oblikovana v kriste, posebne membranske uvihke, ki imajo pomembno vlogo pri samem delovanju organela. Oblika krist se spreminja kot posledica različnih stresnih dejavnikov, vsebnosti različnih količin proteinov ter tvorbe kompleksov in superkompleksov. Veliko raziskav je dokazalo, da imajo kriste pomembno vlogo pri procesu oksidativne fosforilacije, saj skrbijo za pravilno in najučinkovitejšo porazdelitev kompleksov v elektronski prenašalni verigi. Namen raziskav je določiti kako določeni proteini, ki sestavljajo kriste vplivajo na njihovo obliko in delovanje ter kako sama oblika krist vpliva na delovanje mitohondrija. Vprašanje je bilo raziskovano z različnimi genetskimi poskusi na dihalni verigi s pomočjo modelov mišk. S pomočjo različnih raziskav so znanstveniki dokazali, da imajo pri obliki in delovanju krist ključno vlogo različni proteinski kompleksi. Posledica njihovega pomanjkanja ali napačnega delovanja pa je lahko popolnoma nefunkcionalna oblika krist, ki neposredno vpliva na proces oksidativne fosforilacije, posledično se zmanjša njena učinkovitost, mitohondriji proizvajajo zelo malo energije, kar povzroči, da je celica poslana v proces apoptoze.

==Igor Osterc - Reaktivne kisikove zvrsti in mitohondrijska fisija==
Vzdrževanje pravilne koncentracije reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) v celici je ključnega pomena za optimalno delovanje organizma. Ker so ROS zelo reaktivne lahko reagirajo z različnimi encimi, nukleinskimi kislinami in drugimi molekulami ter jih poškodujejo. To ima lahko vpliv na celoten organizem, saj se tako začnejo razvijati mnoge bolezni. Zato mora biti kakršnakoli večja koncentracija ROS od tiste minimalne, ki je potrebna za imunski odziv, proliferacijo in nekatere druge procese v celici, ustrezno razgrajena na celici prijazne produkte. Mitohondriji so glavni proizvajalci ROS v celici in s tem tudi prva tarča njihovega škodljivega delovanja. Največ jih proizvajata kompleksa I in III v elektronski transportni verigi, njihova proizvodnja pa se eksponentno poveča ob prisotnosti različnih inhibitorjev. Mitohondriji imajo zato razvit poseben sistem za zaznavanje prevelike koncentracije ROS in odgovor v obliki cepitve delov, ki jih prekomerno proizvajajo. Poškodovani deli se od zdravih odstranijo s procesom mitohondrijske fisije in gredo v mitofagijo, medtem ko pravilno delujoči del naprej opravlja svoje funkcije. Za preživetje celice je tako pomembno, da se koncentracija ROS vzdržuje znotraj območja, če pa že pride do prenasičenosti z ROS je pomemben učinkovit odgovor na to – dobro reguliran proces fisije.

==Zala Kramar - Vloga proteinov družine Bcl-2 pri intrinzični poti apoptoze==
Apoptoza ali programirana celična smrt je ključen mehanizem uravnavanja števila celic organizma in posledično ključna za vzdrževanje tkivne homeostaze. Ena od apoptotskih poti je intrinzična pot apoptoze, kjer signali delujejo direktno na tarče znotraj celic. Glavni regulatorji te poti so proteini iz družine Bcl-2, ki se nahajajo v citosolu ali so vezani na zunanjo mitohondrijsko membrano. Delimo jih v tri skupine glede na njihovo funkcijo in strukturo. Pro-apoptotski proteini se aktivirajo kot odziv na celični stres in sprožijo apoptozo, anti-apoptotski proteini pa zaustavljajo apoptozo s tem, da se vežejo na pro-apoptotske proteine in jih deaktivirajo. Za začetek apoptoze je ključna oligomerizacija pro-apoptotskih proteinov Bax ali Bak, ki s tvorbo por permeabilizirata zunanjo mitohondrijsko membrano. To povzroči sproščanje citokroma c iz medmembranskega prostora mitohondrija, kar povzroči aktivacijo kaspaz in posledično programirano celično smrt. Ker je razmerje med anti-apoptotskimi in pro-apoptotskimi člani družine Bcl-2 ključno za usodo celice, je to razmerje nadzorovano s strani številnih mehanizmov, kot so fosforilacija, dimerizacija, translokacija, regulacija s transkripcijo,… Če pride do napak pri regulaciji Bcl-2 proteinov, lahko to privede do različnih obolenj, kot so rak, avtoimune bolezni in nevrodegenerativne motnje.