Wiki FKKT - User contributions [en]

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-22T21:58:09Z

Zan Fortuna 69:

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V odsotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega stikala===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 regijo in prvo -35 regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega stikala na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih stikal na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-22T12:44:56Z

Zan Fortuna 69: /* Uvod */

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V odsotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega stikala===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega stikala na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih stikal na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-21T22:24:23Z

Zan Fortuna 69: /* Racionalna zasnova genetskih vezij na osnovi cre mest */

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V prisotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega stikala===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega stikala na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih stikal na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-21T22:24:05Z

Zan Fortuna 69: /* Racionalna zasnova genetskega vezja na osnovi MtlR škatle */

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V prisotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega stikala===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega stikala na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih vezij na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-21T22:21:01Z

Zan Fortuna 69: /* Razvoj na manitol odzivnega genetskega vezja */

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V prisotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega stikala===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega vezja na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih vezij na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-21T22:17:02Z

Zan Fortuna 69:

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V prisotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega vezja===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega vezja na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih vezij na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-21T22:16:34Z

Zan Fortuna 69:

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V prisotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega vezja===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega vezja na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih vezij na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-21T22:16:07Z

Zan Fortuna 69:

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V prisotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega vezja===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega vezja na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih vezij na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-21T22:14:15Z

Zan Fortuna 69: /* Uvod */

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V prisotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega vezja===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega vezja na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih vezij na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Seminarji SB 2022/23

2023-05-21T22:13:24Z

Zan Fortuna 69:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona] (Špela Štor)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_svetlobo_inducirana_produkcija_izobutanola_in_3-metil-1-butanola_z_modificiranimi_cianobakterijami S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami] (Špela Katarina Deučman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raziskovanje_temperaturno_posredovane_replikacije_plazmida_kot_reverzibilnega_in_preklopljivega_proteinskega_ekspresijskega_sistema_v_Escherichia_coli Raziskovanje temperaturno posredovane replikacije plazmida kot reverzibilnega in preklopljivega proteinskega ekspresijskega sistema v ''Escherichia coli''] (Timotej Sotošek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstrukcija_na_manitol_odzivnih_genetskih_stikal_na_osnovi_MtlR_škatle Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle] (Žan Fortuna)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/!MPACT !MPACT] (Jure Povšin)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

2023-05-21T22:10:51Z

Zan Fortuna 69: New page: ''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the ...

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]

==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2].

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. Operon ''mtl'' je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2].

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V prisotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega vezja===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 ohranjeno regijo in prvo -35 ohranjeno regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega vezja na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2].

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 ohranjeni regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 ohranjeno regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih vezij na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 ohranjenima regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 ohranjeno regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].

==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-12T19:35:57Z

Zan Fortuna 69:

==Pritisk na odpornost proti antibiotikom==

Leta 1928 je Alexander Fleming odkril penicilin, izredno učinkovit antibiotik, ki je v prvi polovici dvajsetega stoletja rešil mnogo življenj in bil masovno uporabljan. Toda hkrati z uporabo antibiotikov, se je začela tekma, saj so začeli nastajati na antibiotike odporni sevi bakterij. Več kot se je nekega antibiotika uporabljalo, več vrst bakterij je nanj razvilo odpornost. Dandanes se antibiotiki uporabljajo predvsem v zdravstvu ter živinoreji. Ker pa je uporaba mnogokrat nepreudarna in pretirana, se poraja skrb, ali bo razvoj na antibiotike odpornih bakterij prehitel razvoj novih antibiotikov. Strah ni neracionalen, saj se vlaganje v razvoj povsem inovativnih antibiotikov zmanjšuje.
Antibiotiki se v ogromnih količinah porabljajo pri masovni živinoreji za prehranjevalne potrebe človeške populacije. Tako se v iztrebkih, ki seveda vsebujejo ostanke antibiotikov, začne selektivni pritisk na bakterije, kjer se favorizirajo tiste z antibiotsko odpornostjo, oziroma geni zanjo. V veliki meri se živalski iztrebki uporabljajo kot gnojila pri pridelovanju rastlinske hrane, kjer obstaja možnost prenosa na antibiotike odpornih bakterij na hrano, kar poraja vprašanja o nevarnostih za javno zdravje.

==Vloga bakteriofagov pri širjenju odpornosti na antibiotike==

Bakteriofagi, bakterijski virusi, imajo dva poznana načina razmnoževanja oziroma delovanja. Prvi, najenostavnejši, je litični, kjer fag vbrizga svojo dednino v bakterijo, ta pa nato po vneseni informaciji izdela nove viruse, ki jih sprosti v okolje. Drugi, kompleksnejši način, je lizogen, kjer se virusna dednina vstavi v bakterijsko dednino. Ob aktivatorju (na primer stres) se virusna DNA prepisuje in prevaja, virus pa vstopi v litični cikel. Virusna dednina vsebuje informacije za beljakovinske komponente faga, replikaze, v posebnih in za to temo pomembnih primerih pa tudi bakterijske gene. Omenjeni bakterijski geni, ki se pojavljajo v dednini lizogenih fagov lahko kodirajo toksine, superantigene, T3SS (strukture, ki patogenim bakterijam omogočijo prenos škodljivih proteinov iz bakterijskega citosola direktno v gostiteljsko celico), proteine za pritrjanje na podlago (gostitelja) in gene, ki omogočajo odpornost na antibiotike. Iz napisanega je razvidno, da imajo sami fagi pomemben vpliv na širjenje patogenih in drugih človeku nevarnih lastnosti po bakterijski populaciji.
V resnici so fagi zelo pomembni za kontrolo bakterijskih populacij, pri biogeokemijskih procesih in pri samem evolucijskem razvoju bakterij. Kar 20 % genov vseh bakterij naj bi bilo pridobljenih na omenjen način lizogenega cikla, a vpliv fagov na razvoj bakterij sploh še ni dobro raziskan. Ko virus prenese svojo dednino, ki vključuje bakterijske gene, v bakterijski kromosom, lahko to ne pomeni za gostiteljsko bakterijo nobenih sprememb, lahko so te negativne ali pozitivne. Prek evolucijskih mehanizmov se pozitivne lastnosti pri podvojevanjih, prek plazmidov, pa tudi prek litičnega cikla hitro razširijo po populaciji. V primeru živinoreje se torej ob prisotnosti fagov, ki vsebujejo bakterijske gene za antibiotsko odpornost, število odpornih bakterij v živalskem gnoju hitro razširi zaradi antibiotskega pritiska na bakterije. Na antibiotike odporne bakterije lahko nato preko gnojenja in rastlinske hrane konzumirajo ljudje, kar predstavlja tveganje za javno zdravje, saj je tovrstne okužbe težko zdraviti (pomanjkanje delujočih antibiotikov). Iz napisanega je torej razvidno, da je za celovito borbo proti razširjanju antibiotske odpornosti med bakterijami ključnega pomena, da se razišče vloga fagov v evoluciji bakterij, v odnosih z bakterijskimi kulturami in bolj usmerjeno, pri prenašanju in razširjanju genov antibiotske odpornosti po bakterijskih populacijah.
Nadalje bo v seminarski nalogi opisan mehanizem in regulacija prenosa določenih bakterijskih genov (npr. nosijo gene za antibiotsko odpornost) v virusno dednino, ki se nato preko litičnega cikla lahko razširja po populaciji.

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo izvajajo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga izvajajo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le enoverižno DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

==Voda kot glavni problem onesnaženosti==

Odpadna voda in rastline, ki jih obdelujejo z odpadno vodo, so lahko pravi rezervoar naravnih ponudnikov rezistence na antibiotike. So žarišče horizontalne transferacije genov, kar omogoča razširjanje genov za rezistenco na antibiotike (ARG) med bakterijami. Odpadna voda namreč vsebuje antibiotike, razkužila in kovine, ki lahko pripomorejo k antibiotični rezistenci že v nizkih koncentracijah. Bolnišnice predstavljajo zelo majhen del med viri antibiotikov, na antibiotike rezistentnih bakterij (ARB) in ARG. Zelo veliko jih vsebujejo tudi reke, na katerih poteka več raziskav in primerjav različnih ARG na večih delih reke. Občutljive bakterije lahko pridobijo gen za rezistenco preko transformacije, transdukcije ali konjugacije. Med pridobivanjem enega gena za rezistenco pa lahko v teh procesih bakterija sočasno pridobi tudi številne druge gene za rezistenco na druge antibiotike. Trenutno se za raziskave na tem področju najpogosteje uporabljajo metode, kot so kvantitativna PCR, metagenomika in funkcionalna metagenomika, razvoj novih metod pa konstantno prinaša nove možnosti za analizo ARG.
Pridobitev rezistence je lahko naraven prilagoditveni proces, do nje pride preko spontanih mutacij ali pa se razvije preko horizontalne transferacije gena, ki ga pridobi od donorja, npr. druga bakterija, fagi, ali prosta DNA. Torej lahko tudi nepatogene bakterije, ki vsebujejo ARG, služijo kot rezervoar za patogene bakterije. Predvsem, ko gre za patogene bakterije, pa predstavlja rezistenca globalen problem. Več kot ena miljarda ljudi živi v pomanjkanju pitne vode. Čiščenje vode poteka preko filtracije in kloriranja, a za vse bolj onesnaženo vodo v sedanjem času, to ni zadovoljivo, saj ostane mnogo ARG v vodi. Pitje onesnažene vode je tako zelo ogrožajoče za javno zdravje. Predvsem ostanki neporabljenih antibiotikov v vodi verjetno spodbujajo ARB in ARG. Poleg tega lahko določeni mikrobi preživijo zdravljenje z antibiotiki, ter tako razvijejo rezistenco v odsotnosti genetske mutacije. Del populacije namreč ob velikem številu prisotnih bakterij, lahko preživi sicer letalno koncentracijo. Uporaba antibiotikov pod to koncentracijo tako lahko pripomore k razvoju rezistence tako v klinični medicini, kot v pridelavi rastlin in vzrejanju živali.

===Načini preprečevanja===

Obstaja več možnih sodobnih načinov za razkuževanje vode, ki pa zaenkrat še niso dobro raziskani. Ti vključujejo klor, ozon in železov reagent in lahko inaktivirajo ARB in ARG. Radikal ·OH je glavni oksidant v železovem reagentu. V reakciji radikala s proteinom, se ta razcepi na fragmente, njegova visoka reaktivnost s komponentami DNA in RNA pa povzroči njihovo poškodbo. Inaktivacija bakterij med razkuževanjem ne pomeni nujno uničenja ARG. Da deaktiviramo ARG, potrebujemo tako dezinfekcijsko sredstvo, ki čim hitreje prodre celično membrano in pride do DNA, ne da bi se vmes vezal kam drugam. Nekatere študije so preučevale tudi pomen ultravijoličnega (UV) obsevanja in ga primerjala s kloriranjem. Odkrili so, da tako kloriranje, kot UV obsevanje ne uničita veliko ARG, medtem ko v kombinaciji skupaj lahko zelo učinkovito inaktivirata ARG. Primerjava med obema metodama je pokazala, da UV obsevanje direktno uniči plazmid, ki vsebuje ARG, celična membrana pa ostane nespremenjena. Klor pa skupaj z amonijevim ionom, ki je prisoten v vodi, tvori kloramin, ki poveča permeabilnost celične membrane. Kloriranje vode lahko tako celo prispeva k transferaciji ARG, UV obsevanje je tako lahko primernejša oblika dezinfekcije za kontrolo ARG transferacije.

==Viri==

Sengupta S., Chattopadhyay M. K., Grossart H. P., 2013, "The multifaceted roles of antibiotics and antibiotic resistance in nature." Front Microbiol. 12, 4-47.

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

Sharma, V.K. et al. (2016) A review of the influence of treatment strategies on antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere 150, 702–714

Karkman, A. et al. (2018) Antibiotic-resistance genes in waste water. Trends Microbiol. 26, 220–228

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-12T09:58:02Z

Zan Fortuna 69:

'''Tevž Levstek''': Pritisk na antibiotsko rezistenco in vloga bakteriofagov pri širjenju rezistence

'''Žan Fortuna''': Posredniki prenosa genov, njihov življenjski cikel in vnos dednega materiala

'''Lara Drinovec''': Voda kot glavni problem onesnaženosti in načini preprečevanja

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-12T09:55:19Z

Zan Fortuna 69:

==Pritisk na antibiotsko rezistenco==

Leta 1928 je Alexander Fleming odkril penicilin, izredno učinkovit antibiotik, ki je v prvi polovici dvajsetega stoletja rešil mnogo življenj in bil masovno uporabljan. Toda hkrati z uporabo antibiotikov, se je začela tekma, saj so začeli nastajati na antibiotike rezistentni sevi bakterij. Več kot se je nekega antibiotika uporabljalo, več vrst bakterij je nanj razvilo rezistentnost. Dandanes se antibiotiki uporabljajo predvsem v zdravstvu ter živinoreji. Ker pa je uporaba mnogokrat nepreudarna in pretirana se poraja skrb, ali bo razvoj rezistentnih bakterij prehitel razvoj novih antibiotikov. Strah ni neracionalen, saj se vlaganje v razvoj povsem inovativnih antibiotikov zmanjšuje.
Antibiotiki se v ogromnih količinah porabljajo pri masovni živinoreji za prehranjevalne potrebe človeške populacije. Tako se v iztrebkih, ki seveda vsebujejo ostanke antibiotikov, začne selektivni pritisk na bakterije, kjer se favorizirajo tiste z rezistenco, oziroma geni za rezistenco. V veliki meri se živalski iztrebki uporabljajo kot gnojila pri pridelovanju rastlinske hrane, kjer obstaja možnost prenosa rezistentnih bakterij na hrano, kar poraja vprašanja o nevarnostih za javno zdravje.

==Vloga bakteriofagov pri širjenju rezistence==

Bakteriofagi, bakterijski virusi, imajo dva poznana načina razmnoževanja oziroma delovanja. Prvi, najenostavnejši, je litični, kjer fag vbrizga svojo dednino v bakterijo, ta pa nato po vneseni informaciji izdela nove viruse, ki jih sprosti v okolje. Drugi, kompleksnejši način, je lizogen, kjer se virusna dednina vstavi v bakterijsko dednino. Ob aktivatorju (na primer stres) se virusna DNA prepisuje in prevaja, virus pa vstopi v litični cikel. Virusna dednina vsebuje informacije za beljakovinske komponente faga, replikaze, v posebnih in za to temo pomembnih primerih pa tudi bakterijske gene. Omenjeni bakterijski geni, ki se pojavljajo v dednini lizogenih fagov lahko kodirajo toksine, superantigene, T3SS (strukture, ki patogenim bakterijam omogočijo prenos škodljivih proteinov iz bakterijskega citosola direktno v gostiteljsko celico), proteine za pritrjanje na podlago (gostitelja) in gene, ki omogočajo rezistenco na antibiotike. Iz napisanega je razvidno, da imajo sami fagi pomemben vpliv na širjenje patogenih in drugih človeku nevarnih lastnosti po bakterijski populaciji.
V resnici so fagi zelo pomembni za kontrolo bakterijskih populacij, pri biogeokemijskih procesih in pri samem evolucijskem razvoju bakterij. Kar 20 % genov vseh bakterij naj bi bilo pridobljenih na omenjen način lizogenega cikla, a vpliv fagov na razvoj bakterij sploh še ni dobro raziskan. Ko virus prenese svojo dednino, ki vključuje bakterijske gene, v bakterijski kromosom, lahko to ne pomeni za gostiteljsko bakterijo nobenih sprememb, lahko so te negativne ali pozitivne. Prek evolucijskih mehanizmov se pozitivne lastnosti pri podvojevanjih, prek plazmidov, pa tudi prek litičnega cikla hitro razširijo po populaciji. V primeru živinoreje se torej ob prisotnosti fagov, ki vsebujejo rezistentne bakterijske gene, rezistentnost bakterij v živalskem gnoju hitro razširi zaradi antibiotskega pritiska na bakterije. Rezistentne bakterije lahko nato preko gnojenja in rastlinske hrane konzumirajo ljudje, kar predstavlja tveganje za javno zdravje, saj je tovrstne okužbe težko zdraviti (pomanjkanje delujočih antibiotikov). Iz napisanega je torej razvidno, da je za celovito borbo proti razširjanju antibiotske rezistence med bakterijami ključnega pomena, da se razišče vloga fagov v evoluciji bakterij, v odnosih z bakterijskimi kulturami in bolj usmerjeno, pri prenašanju in razširjanju genov rezistence po bakterijskih populacijah.
Nadalje bo v seminarski nalogi opisan mehanizem in regulacija prenosa določenih bakterijskih genov (npr. nosijo gene za rezistentnost) v virusno dednino, ki se nato preko litičnega cikla lahko razširja po populaciji.

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

==Voda kot glavni problem onesnaženosti==

Odpadna voda in rastline, ki jih obdelujejo z odpadno vodo, so lahko pravi rezervoar naravnih ponudnikov rezistence na antibiotike. So žarišče horizontalne transferacije genov, kar omogoča razširjanje genov za rezistenco na antibiotike (ARG) med bakterijami. Odpadna voda namreč vsebuje antibiotike, razkužila in kovine, ki lahko pripomorejo k antibiotični rezistenci že v nizkih koncentracijah. Bolnišnice predstavljajo zelo majhen del med viri antibiotikov, na antibiotike rezistentnih bakterij (ARB) in ARG. Zelo veliko jih vsebujejo tudi reke, na katerih poteka več raziskav in primerjav različnih ARG na večih delih reke. Občutljive bakterije lahko pridobijo gen za rezistenco preko transformacije, transdukcije ali konjugacije. Med pridobivanjem enega gena za rezistenco pa lahko v teh procesih bakterija sočasno pridobi tudi številne druge gene za rezistenco na druge antibiotike. Trenutno se za raziskave na tem področju najpogosteje uporabljajo metode, kot so kvantitativna PCR, metagenomika in funkcionalna metagenomika, razvoj novih metod pa konstantno prinaša nove možnosti za analizo ARG.
Pridobitev rezistence je lahko naraven prilagoditveni proces, do nje pride preko spontanih mutacij ali pa se razvije preko horizontalne transferacije gena, ki ga pridobi od donorja, npr. druga bakterija, fagi, ali prosta DNA. Torej lahko tudi nepatogene bakterije, ki vsebujejo ARG, služijo kot rezervoar za patogene bakterije. Predvsem, ko gre za patogene bakterije, pa predstavlja rezistenca globalen problem. Več kot ena miljarda ljudi živi v pomanjkanju pitne vode. Čiščenje vode poteka preko filtracije in kloriranja, a za vse bolj onesnaženo vodo v sedanjem času, to ni zadovoljivo, saj ostane mnogo ARG v vodi. Pitje onesnažene vode je tako zelo ogrožajoče za javno zdravje. Predvsem ostanki neporabljenih antibiotikov v vodi verjetno spodbujajo ARB in ARG. Poleg tega lahko določeni mikrobi preživijo zdravljenje z antibiotiki, ter tako razvijejo rezistenco v odsotnosti genetske mutacije. Del populacije namreč ob velikem številu prisotnih bakterij, lahko preživi sicer letalno koncentracijo. Uporaba antibiotikov pod to koncentracijo tako lahko pripomore k razvoju rezistence tako v klinični medicini, kot v pridelavi rastlin in vzrejanju živali.

===Načini preprečevanja===

Obstaja več možnih sodobnih načinov za razkuževanje vode, ki pa zaenkrat še niso dobro raziskani. Ti vključujejo klor, ozon in železov reagent in lahko inaktivirajo ARB in ARG. Radikal ·OH je glavni oksidant v železovem reagentu. V reakciji radikala s proteinom, se ta razcepi na fragmente, njegova visoka reaktivnost s komponentami DNA in RNA pa povzroči njihovo poškodbo. Inaktivacija bakterij med razkuževanjem ne pomeni nujno uničenja ARG. Da deaktiviramo ARG, potrebujemo tako dezinfekcijsko sredstvo, ki čim hitreje prodre celično membrano in pride do DNA, ne da bi se vmes vezal kam drugam. Nekatere študije so preučevale tudi pomen ultravijoličnega (UV) obsevanja in ga primerjala s kloriranjem. Odkrili so, da tako kloriranje, kot UV obsevanje ne uničita veliko ARG, medtem ko v kombinaciji skupaj lahko zelo učinkovito inaktivirata ARG. Primerjava med obema metodama je pokazala, da UV obsevanje direktno uniči plazmid, ki vsebuje ARG, celična membrana pa ostane nespremenjena. Klor pa skupaj z amonijevim ionom, ki je prisoten v vodi, tvori kloramin, ki poveča permeabilnost celične membrane. Kloriranje vode lahko tako celo prispeva k transferaciji ARG, UV obsevanje je tako lahko primernejša oblika dezinfekcije za kontrolo ARG transferacije.

==Viri==

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

Sharma, V.K. et al. (2016) A review of the influence of treatment strategies on antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere 150, 702–714

Karkman, A. et al. (2018) Antibiotic-resistance genes in waste water. Trends Microbiol. 26, 220–228

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-11T18:20:53Z

Zan Fortuna 69:

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

==Viri==

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-11T18:17:13Z

Zan Fortuna 69:

'''Žan Fortuna''': Posredniki prenosa genov, njihov življenjski cikel in vnos dednega materiala

Talk:Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-11T18:16:59Z

Zan Fortuna 69: New page: Žan Fortuna: Posredniki prenosa genov, njihov življenjski cikel in vnos dednega materiala

Žan Fortuna: Posredniki prenosa genov, njihov življenjski cikel in vnos dednega materiala

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-11T18:14:45Z

Zan Fortuna 69:

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-11T18:11:31Z

Zan Fortuna 69: New page: ==Posredniki prenosa genov== Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakteri...

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

Bakteriofagi

2020-05-11T18:00:13Z

Zan Fortuna 69:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.

Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Poglavja za seminarje so:

'''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV''' 
https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019) 
1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019) 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via% 
(pregledni, 2018) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via% 
(pregledni, 2020) 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 

'''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA''' 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019) 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063 
9. Interakcija faga z bakterijo 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi 

https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema) 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643 
(pregledni, 2019+2020) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via% 
(pregledni, 2019) 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013) 
14. Cianofagi 

'''UPORABA BAKTERIOFAGOV''' 

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/ 
(pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 

https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04- 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm 
in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič) 

1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 
5. [[Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda]] (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) 
6. [[Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni]] (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik) 
7. [[Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina]] (Anja Konjc, Tina Logonder, Manca Osolin) 
8. [[Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave]] (Tina Arnšek, Ana Babnik, Greta Junger) 
9. [[Interakcija faga z bakterijo]] (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik, Ana Vičič) 
10.[[Interakcije fagov s človeškimi tkivi]] (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman) 
11. [[Fagi v naravnih in umetnih okoljih]] (Lena Trnovec, Maja Kolar, Liza Praznik) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 
13. [[Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom]] (Žan Fortuna, Tevž Levstek, Lara Drinovec) 
14. [[Cianofagi]] (Timotej Zgonik) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič) 
16. [[Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh]] (Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob) 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje (Maja Mahorič, Ana Potočnik, Maja Trifkovič) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin (Tanja Janko, Špela Šubelj in Matic Krivec) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek, Oskar Nemec) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Bakteriofagi

2020-03-12T20:16:47Z

Zan Fortuna 69:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.

Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Poglavja za seminarje so:

'''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV''' 
https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019) 
1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019) 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via% 
(pregledni, 2018) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via% 
(pregledni, 2020) 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 

'''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA''' 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019) 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063 
9. Interakcija faga z bakterijo 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi 

https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema) 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643 
(pregledni, 2019+2020) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via% 
(pregledni, 2019) 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013) 
14. Cianofagi 

'''UPORABA BAKTERIOFAGOV''' 

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/ 
(pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 

https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04- 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm 
in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič) 

1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 
9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom (Žan Fortuna, Tevž Levstek) 
14. Cianofagi 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič) 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob) 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

BIO2 Povzetki seminarjev 2019

2020-01-10T17:10:50Z

Zan Fortuna 69:

== Kim Glavič: ATP KOT SIGNALNA MOLEKULA ŽIVALI IN RASTLIN ==

Molekula ATP ni le temeljni vir energije za mnoge procese v celici, temveč tudi signalna molekula v zunajceličnem matriksu živali in rastlin. ATP, kot velika polarna molekula, se iz celic rastlin izloči s pomočjo eksocitotskih veziklov ali ATP prenašalcev. Iz živalskih celic pa s pomočjo eksocitotskih veziklov, ATP prenašalcev ali koneksonskih hemikanalčkov. Ob povečanih koncentracijah molekul ATP v zunajceličnem matriksu se te vežejo na ustrezne P2- receptorje. Po sprostitvi nazaj v matriks pa njihovo koncentracijo uravnavajo ekto-nukleotidaze. Na splošno aktivacija P2- receptorjev povzroči povišanje koncentracije kalcijevih ionov in dušikovega monoksida v citosolu celice ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti v zunajceličnem matriksu. Kalcijevi ioni, dušikov monoksid in reaktivne kisikove zvrsti so sekundarni obveščevalci, ki so ključni za fiziološki odziv celice. Rastlinska ATP-signalizacija ima pomembno vlogo pri časovni regulaciji kalitve cvetnega prahu, rasti pelodne cevke, nastanku koreninskih gomoljev in zaznavanju ter posledično izogibanju oviram pri rasti korenin. Živalska ATP-signalizacija sodeluje pri nastanku imunskega odziva, prenosu živčnih signalov, celični smrti in regulaciji mnogih drugih procesov.

== Tevž Levstek: GLICINSKI TRANSPORTERJI KOT TERAPEVTSKE TARČE ==

Glicin je proteinogena aminokislina, ki opravlja tudi funkcijo signalne molekule, natančneje nevrotransmiterja. Najdemo ga v dveh vrstah sinaps: glicinergičnih, kjer je glavni nevrotransmiter in glutamatergičnih, kjer ima pomožno vlogo, saj pomaga glutamatu pri signaliziranju. Koncentracije glicina v medceličnini regulirajo glicinski transporterji, ki jih delimo na GlyT1 in GlyT2. Glicinergična sinapsa je inhibitorna, kar pomeni, da če glicin aktivira svoj receptor, posinaptično celico hiperpolarizira (še poveča raven kloridnih ionov v njej). V tej sinapsi GlyT1 zmanjšuje koncentracijo glicina, saj ga transportira v okoliške glia celice. GlyT2 po drugi strani pa zvišuje koncentracijo glicina, saj zbira razpršen glicin, ga reciklira in omogoči ponovno usmerjeno pošiljanje proti receptorjem. V glutamatergičnih sinapsah pa je glicin skupaj z glutamatom ekscitatorna signalna molekula. Če se glicin veže na protein NMDA, ki je na posinaptični membrani, mu s pozitivno alosterično modifikacijo olajša vezavo z glutamatom, ki odpre kationski kanalček in depolarizira celico. Tu regulira koncentracijo glicina le GlyT1, ki jo zmanjšuje, GlyT2 pa tu ne nastopa. Razumevanje delovanja obeh sinaps nam lahko omogoči sintezo novih zdravil, ki bi bolj učinkovito delovala proti nekaterim duševnim boleznim kot so shizofrenija, alkoholizem, obsesivno-kompulzivna motnja in še precej drugim. Ta zdravila najpogosteje inhibirajo delovanje GlyT1 in imajo veliko uspešnost pri glodalcih. Pri ljudeh pa na žalost še ni bilo dobrih rezultatov in na razvoj tovrstnega zdravila še čakamo.

== Ana Potočnik: FOSFATIDILSERIN KOT SIGNALNA MOLEKULA ==

Fosfatidilserin je glicerofosfolipid in pomemben gradnik celičnih membran. V zdravih in živečih celicah se nahaja izključno na notranji, citosolni strani fosfolipidnega dvosloja. To asimetrično razporeditev s pomočjo ATP vzpostavlja aminofosfolipidna translokaza. Poleg svoje strukturne vloge ima fosfatidilserin tudi pomembno funkcijo v mnogih signalizacijskih poteh. Kot signalna molekula sodeluje pri koagulaciji krvi, fagocitozi apoptoznih celic, celični fuziji in odlaganju mineralov v osteoblaste. Ključna lastnost fosfatidilserina kot signalne molekule je njegova negativno nabita polarna glava. Preko nje fosfatidilserin z drugimi signalnimi molekulami ali receptorji tvori elektrostatske ali stereospecifične interakcije. Sodeluje pri signalizaciji znotraj celice in tudi pri ekstracelularni signalizaciji. Ko sodeluje pri ekstracelularni signalizaciji, se nahaja tudi na ekstracelularni strani fosfolipidnega dvosloja. Prehod fosfatidilserina iz notranje na zunanjo stran uravnavajo skramblaze. Te so lahko aktivirane s pomočjo kaspaz, ki so encimi, prisotni v apoptozni celici. Med molekulami, ki se vežejo na fosfatidilserin, so najbolj preučevane tiste, ki za vezavo nanj uporabijo Gla domeno. Laktahedrin, ki je na fagocit vezan preko integrinov αvβ3, z vezavo na fosfatidilserin apoptozno celico pritrdi k makrofagu. Gas6 in protein S, ki se prav tako vežeta na fosfatidilserin, pa preko TAM receptorjev sprožita tirozinkinazno aktivnost. Aktivira se Rac1 in polimerizacija aktina sproži fagocitozo apoptozne celice. Izpostavljenost fosfatidilserina na ekstracelularni strani celice je zadosten signal makrofagu, da fagocitira celico. To nakazuje na pomembno vlogo fosfatidilserina kot signalne molekule.

== Tadej Uršič: TLR SIGNALIZACIJA IN NJENA VLOGA PRI REVMATIČNIH BOLEZNIH ==

Prirojeni imunski sistem predstavlja prvi obrambni mehanizem organizma. Celice prirojenega imunskega sistema izražajo receptorje, ki zaznavajo določene gradnike bakterij in virusov in pa molekule, ki nastanejo pri poškodbah samega organizma. Ti receptorji sprožijo signalne poti ki privedejo do odgovora organizma na vdor patogena. Ena od skupin teh receptorjev so TLR (Toll-Like Receptors). So integralni proteini za katere je značilna z levcini bogata ektodomena za prepoznavanje ligandov in pa TIR domena za navzdoljno signalizacijo. TLR-ji prepoznavajo komponente membran (lipide, lipopolisaharide, lipoproteini, …) in nukleinske kisline bakterij in virusov in kot odgovor sprožijo vnetno reakcijo. Če je le ta normalno regulirana le ta pripomore pri odpravi vdirajočih patogenov v organizem. Če pa pride do napak v regulaciji to lahko privede do kroničnega vnetja tkiva. Pri revmatičnih obolenjih, kot so na primer revmatoidni artritis, putiki, lymski artritis, lupus… , so odkrili večjo izraženost TLR-jev, kar je lahko glavni razlog za njihov nastanek. Znanstveniki sedaj testirajo razne inhibitorje TLR-jev ali pa njihovih adaptornih proteinov, kot potencialna zdravila za te bolezni.

== Nika Vegelj : FORMACIJA BIOFILMA V POVEZAVI S C-DI-GMP MOLEKULO ==

Za bakterijo, kot tudi za vsa ostala živa bitja je nujno, da se prilagajajo na spreminjanje življenjskih pogojev, saj jim to omogoča preživetje. Molekula c-di-GMP je sekundarni sporočevalev pri baktrerijah, ki regulira različne celične procese. C-di-GMP so prvič odkrili kot alosterični aktivator celulozne sintetaze v bakteriji Gluconacetobacter xylinum. Pri patogenih organizmih molekula c-di-GMP kontrolira virulentni odgovor, ki je povezan s quorum sensingom, procesom s katerim bakterije med seboj komunicirajo. Koncentracija molekule c-di-GMP je v celici regulirana s pomočjo encimov fosfodiesteraz in gvanilat ciklaz. C-di-GMP je sintetizirana znotraj celice iz dveh molekul GTP s pomočjo encima digvanilat ciklaze, ki na aktivni strani nosi domeno GGDEF. Razpad molekule pa omogoča encim fosfodiesteraza, ki nosi domeno EAL, ta omogoča, da molekula razpade na linearni nukleotid pGpG. Glavni namen raziskovanja molekule c-di-GMP ter njene vloge pri tvorbi biofilma, je bil, da bi ugotovili nove metode, ki bi preprečile nastanek biofilma in tako pozdravile z njim povezane bolezni. Cistična fibroza je ena izmed najpogostejših bolezni v evropi, za njo pa je odgovorna bakterija pseudomonas aeruginosa, ki s tvorbo biofilma povzroča kronično obolenje, saj antibiotiki ne delujejo direktno na biofilm. C-di-GMP je sekundarni sporočevalec pri bakterijah, ne pa tudi pri evkariontih in arhejah. Prav zato je tako zanimiv za znanstvenike, saj lahko z razvojem zdravil, ki bi vplivale na molekulo, razvili potencialna zdravila za kronične bolezni.

== Maja Kolar: BIOKEMIJSKA LOGIKA GLIKOLIZE ==
Čeprav glikoliza sprva zgleda zapletena in naključna, je v smislu zadovoljevanja vsem biokemijskim zahtevam ena najenostavnejših metabolnih poti. Pri načrtovanju poti se je treba zavedati kompromisov za zadovoljevanje različnim omejitvam, zato lahko skozi analizo vseh teoretično možnih poti ugotovimo katera je celici najugodnejša. Termodinamske omejitve vključujejo Gibbsovo prosto entalpijo reakcij, ki jo lahko izračunamo iz redoks potencialov in ugotovimo katere poti v metabolizmu so ender-/eksergonske. Pri encimskih mehanizmih moramo upoštevati aktivacijske skupine, ki pa lahko povečajo reaktivnost intermediatov, kar spada pod fizikalno-kemijske lastnosti intermediatov. Med njih štejemo tudi prepustnost skozi membrano, afiniteto do encimov in toksičnost. Slednjo celica izniči z izogibanjem reakcijskim potem ali sistemi endogene detoksifikacije kot je sistem glioksalaz za intermediat metilglioksal. Pri glikolizi se jim celica izogne z delitvijo elektronske prerazporeditve, kjer po podobnih poteh ne nastopajo toksične spojine. Preko energij vezi in elektronskih prerazporeditev lahko določimo kje na glikolizni poti bo nastajal ATP. Najobsežnejše zastopana je glikoliza Embden-Meyerhof-Parnas, vendar njene naravne alternative dokazujejo, da so skozi evolucijo različni organizmi kot so anaerobne/aerobne bakterije, termofili obravnavali določene zahteve kot bolj ali manj pomembne. Znanje različnih bioloških zahtev pa lahko prenesemo na metabolni inženiring, kjer iščemo učinkovite rešitve za proizvodnjo industrijsko iskanih metabolitov.

== Jure Povšin: VPLIV DIMETIL FUMARATA NA GAPDH IN AEROBNO GLIKOLIZO PRI MODULACIJI IMUNOSTI ==
Aktivirane imunske celice se po Warburgovi hipotezi osredotočijo na izvajanje aerobne glikolize namesto na izvajanje oksidativne fosforilacije, s čimer predstavljajo potencialno terapevtsko tarčo pri avtoimunski boleznih. Dimetil fumarat (DMF), je derivat od intermediarnega fumarata iz Krebsovega cikla. DMF je ester fumarne kisline ter imunomodulacijsko zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje multiple skleroze in luskavice. Čeprav njegov terapevtski mehanizem zaenkrat ostaja še negotov, je znano, da DMF kovalentno spreminja ostanke cisteina v procesu, imenovanem succination. Preiskovanje aktivnost DMF-ja dodatno zapleta njegova hidroliza in vivo do monometil fumarata (MMF), ki lahko tudi sam modulira imunski odziv in vnetje tkiv. Kornberg in sodelavci so ugotovili , da DMF pri procesu, imenovanem succination, inaktivira katalitični cistein glikolitičnega encima gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) pri miših in ljudeh, tako in vitro kot in vivo. S tem navzdol uravnava aerobno glikolizo v aktiviranih mieloidnih in limfoidnih celicah, kar povrzoča njene protivnetne učinke. Rezultati znanstvenikov zagotavljajo mehanski vpogled v imunsko modulacijo z DMF in predstavljajo dokaz koncepta, da je aerobna glikoliza lahko zelo pomembna terapevtska tarča v avtoimunosti in da nas lahko nadaljnje raziskovanje pripelje do dolgo iskanih zdravil proti hudim avtoimunim boleznim.

== Manca Osolin: REGULACIJA METABOLIZMA GLUKOZE IN LAKTATA V MOŽGANIH ==
Aerobna glikoliza je proces razgradnje glukoze do laktata v prisotnosti kisika. Proces aerobne glikolize je med drugim značilen tudi za astrocite, posebne celice v možganih. Ker imajo nevroni večjo potrebo po energiji kot astrociti, vzdržujejo visok nivo oksidativnega metabolizma, medtem ko astrociti favorizirajo aerobno glikolizo in omejujejo oksidativno aktivnost. Številne raziskave so pokazale, da astrociti laktat, ki nastane v procesu aerobne glikolize, posredujejo nevronom. Ta koncept se imenuje ANLS hipoteza. Nevroni morajo vzdrževati ravnotežje med pentoza fosfatno potjo in glikolitično potjo, da dosežejo potrebe po energiji in da vzdržujejo antioksidativni potencial. Zato uporaba laktata kot oksidativnega substrata lahko zagotavlja ugoden način za nevrone, da proizvedejo visoke količine ATP med zaobidenjem glikolitične poti, saj tako varčujejo glukozo za pentoza fosfatno pot. Aerobna glikoliza, ki poteka v astrocitih in katere končni produkt je laktat, ima pomembno vlogo pri vzdrževanju nevronske aktivnosti. Laktat se prenese iz astrocitov v nevrone, da zadosti energijskim potrebam nevronov, prav tako pa laktat deluje tudi kot signalna molekula, ki regulira nevronske funkcije, kot so vzdražnost in plastičnost nevronov ter okrepitev spomina. V možganih se nahaja tudi posebna vrsta nevronov, ki na različne mehanizme zaznavajo spremembe koncentracije glukoze, kar jim omogoča prilagajanje na zunanje spremembe preko depolarizacije.

== Greta Junger: INTERMEDIATI CIKLA CITRONSKE KISLINE: SIGNALNE MOLEKULE POD KRINKO ==
Cikel citronske kisline je centralna metabolna pot, pri kateri se energetsko bogata molekula acetil-CoA oksidira ter svoje elektrone odda prenašalcem. Oksidacija je postopna in poteka preko več intermediatov. Za njih je dolgo časa veljalo, da je to njihova edina vloga, vendar pa se je ta domneva izkazala za napačno. Večina intermediatov cikla citronske kisline ima namreč večstransko vlogo, saj sodelujejo tako pri signalizaciji kot tudi regulaciji različnih procesov. Za delovanje α ketoglutarat-odvisnih dioksigenaz (2-OGDO) je nujno potreben α ketoglutarat. Zaradi podobne kemijske zgradbe se na 2-OGDO lahko vežeta tudi sukcinat in fumarat, ki pa encima ne aktivirata, pač pa delujeta kot kompetitivna inhibitorja. Kot taka lahko v celici ustvarita pseudo-hipoksično stanje ali pa posredno vplivata na spremembo demetilacije DNA in histonov. Poleg omenjenega imajo nekateri intermediati ključno vlogo tudi pri post-translacijski modifikaciji proteinov, natančneje acetilaciji, sukcinaciji in sukcinilaciji Lys in Cys ostankov. Za sukcinat in α ketoglutarat obstajata specifična GPC-receptorja - SUCNR1 in OXGR1. Fiziološki pomen SUCNR1, ki se med drugim nahaja v ledvicah, srčnem tkivu in očeh, je bolje raziskan od OXGR1O. Nedolgo nazaj so pojasnili tudi vlogo sukcinata pri nastanku reaktivnih kisikovih zvrsti in obratnega toka elektronov.

== Oskar Nemec: Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline ==
Glede na to, da je cikel citronske kisline (TCA) osnovno vozlišče (energijskega) metabolizma celic, je smiselno sklepati, da je aktivacija celic naravne imunosti in njihova regulacija s tem procesom povezana. Imunski odziv je namreč energijsko potraten proces in v veliki meri odvisen od mitohondrijskega metabolizma. Izkazalo se je, da intermediati TCA, kot so sukcinat, itakonat, citrat in fumarat, posredujejo ali uravnavajo pomembne funkcije mieloidnih celic (levkocitov) med okužbo in vnetjem. Aktivacija levkocitov, ki se zgodi v sklopu vnetnega procesa z vnetnimi dejavniki vodi v preoblikovanje cikla in kopičenje teh intermediatov v celici. Sukcinat ima vnetni učinek, ker povzroči stabilizacijo HIF-1 (hypoxia inducible factor 1), povečanje količine mROS (reaktivne kisikove zvrsti mitohondrija), postranslacijske modifikacije proteinov z sukcinilacijo in signalizacijo preko z G-proteinom sklopljenimi receptorji (klasična kaskada). Citrat prav tako spodbuja vnetni odziv, saj se zaradi njega sintetizirajo reaktivne kisikove in dušikove zvrsti ter prostaglandin E2. Itakonat pa ima protivnetno vlogo, saj zavira SDH in omeji vnetne učinke sukcinata, sposoben je pa tudi, v nasprotju s sukcinatom, sam ubiti patogene. Vloga fumarata v vnetnem procesu ni dokončno pojasnjena, znano pa je da povzroča med drugimi zmanjšanje količine ROS in tako zmanjša vnetni odziv.

== Teo Nograšek: GPR91: PREMIKANJE MEJA INTERMEDIATOV KREBSOVEGA CIKLA ==
Sukcinat je najbolj poznan kot intermediat Krebsovega cikla, vendar so novejše raziskave pokazale, da ima tudi pomembno funkcijo kot signalna molekula. Celice v hipoksiji sintetizirajo in izločajo sukcinat, ki se nato veže na receptor GPR91. GPR91 je najden v celicah jeter, krvnih celicah, maščobnih celicah, ledvičnih celicah in celicah mrežnice. V jetrih signal iz receptorja GPR91 vpliva na Itove celice, ki so zadolžene za izločanje kolagena pri poškodbi jeter. V mrežnici je GPR91 izražen v nevronskih celicah ganglijev in njegova aktivacija povzroči neovaskularizacijo. Aktivacija GPR91 v ledvicah povzroči povišanje krvnega tlaka preko renina. Povišan krvni tlak lahko povzroči hipertrofijo, na nastanek hipertrofije pa vpliva tudi sama vezava med sukcinatom in receptorjem GPR91 na srčnih mišičnih celicah, kar povzroči transkripcijo genov za nastanek hipertrofije. Poleg tega visoka koncentracija sukcinata povzroči apoptozo srčnih celic. Raziskave na področju zaviranja delovanja GPR91 bi lahko omilile zaplete, ki nastanejo pri transplantaciji, ker je bilo odkrito, da imajo pacienti po transplantaciji povišano količino sukcinata v krvi, kar vodi do zapletov.

== Ana Babnik: REGULACIJA OKSIDACIJE MAŠČOBNIH KISLIN V SKELETNIH MIŠICAH PRI AEROBNI VADBI ==
Krčenje mišic pri aerobni vadbi zahteva dodatno energijo, ki jo lahko celice pridobijo iz znotrajceličnih in telesnih virov glukoze in maščobnih kislin. Na izbiro substrata, ki se bo v večji meri porabljal za končno sintezo ATP, vplivata intenzivnost in trajanje vadbe. Oksidacija maščobnih kislin je regulirana z mnogimi prepletenimi signalnimi potmi in regulacijskimi mehanizmi, kateri pa še niso v celoti poznani. Glavni regulator vnosa maščobnih kislin v celico je CD1/SR-B2 (receptor čistilec B2), ki s svojo translokacijo iz veziklov na membrano in interakcijo s FABP olajša vnos maščobnih kislin v celico. Naslednja pomembna točka je prenos substratov v celico v obliki acil-CoA, pri čimer sodeluje CPT1, ki za prenos potrebuje prosti karnitin, na njegovo delovanje pa vpliva mnogo regulatorjev. Sama regulacija delovanja CPT1 pa je povezana tudi s celično homeostazo acetil-CoA in kot že omenjenega prostega karnitina, saj se ta pri presežkih v količini acetil-CoA porablja za nastanek acetilkarnitina. Regulatorni mehanizmi β-oksidacije dokazujejo, da se pri daljši oziroma vadbi z nižjo intenziteto za sintezo acetil-CoA (in nadaljnjo sintezo ATP) porabljajo predvsem maščobne kisline, medtem ko se pri bolj intenzivni vadbi porablja glukoza.

== Nastja Feguš: VEČDIMENZIONALNA VLOGA KETONSKIH TELES ==
Aceton, acetoacetat in D-β-hidroksibutirat so ketonska telesa. Bakterije, arheje in evkarionti jih uporabljamo kot alternativni vir energije. Pri sesalcih so ketonska telesa pomemben alternativni vir energije za možgane, srce in skeletne mišice. Ketosnka telesa na dan prispevajo med 5 % in 20 % energije. Tvorba ketonskih teles primarno poteka v jetrih, saj imajo le jetra in celice kolonskega epitela v črevesju izražen encim, ki katalizira prvo reakcijo nastanka ketonskih teles, vendar obstajajo tudi mehanizmi nehepatične sinteze ketonskih teles. Usoda ketonskih teles ni vedno oksidacija oziroma pretvorba v acetil-CoA, lahko se pretvorijo v različne intermediate, ki se lahko uporabijo v biosintezi sterolov in maščobnih kislin. Ketonska telesa so zelo dobri antioksidanti, njihova funkcija je zelo pomembna v možganih, kjer znižajo stopnjo celičnih poškodb nevronov. D-β-hidroksibutirat je epigenetski modifikator, saj direktno modificira lizinske ostanke histonov. D-β-hidroksibutirat je tudi pomembna signalna molekula. Je direkten inhibitor encimov razreda HDACs. Inhibicija teh encimov poveča acetilacijo encimov in inducira izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres. Prav tako se veže na dva različna z G proteinom povezana receptorja, preko te signalne poti zmanjša lipolizo, upočasni srčni utrip in zmanjša porabo energije.

== Maša Andoljšek: DOBRE STARE MAŠČOBE: POVEZAVA MED SIGNALIZACIJO LIPIDOV IN ŽIVLJENJSKO DOBO ==
Lipidi kot signalne molekule ali transkripcijski faktorji sodelujejo v procesih, ki podaljšujejo življenje. Večina raziskav poteka na glisti ''Caenorhabditis elegans'', saj ima kratko življenjsko dobo in se lahko genetsko manipulira. Obstajajo tri metode podaljševanja življenja, ki delujejo na več vrstah organizmov. Prva je inzulin signalirajoča pot, ki s pomočjo dafakronske kisline, holesterola in jedrnih receptorjev DAF-12 ter DAF-16, regulira življenjsko dobo in sproža avtofagijo. Drug način je dietna restrikcija, ki pa lahko poteka preko mutacije eat-2, preko razredčevanja hrane in preko občasnega postenja. Pri tem načinu sodeluje DAF-16, NHR-8 in NHR-64. Dietna restrikcija ima pozitivne vplive na zdravje. Zadnji način podaljšanja življenjske dobe je izrez signalov zarodne plasti, kar promovira lipolizo, metabolizem lipidov itd. Te raziskave kažejo, da je možna uporaba lipidov tudi za zdravljenje različnih bolezni, za kar pa se nekateri že uporabljajo. Pomembna je tudi akumulacija različnih molekul, na primer oleinske kisline pri staranju. Veda, ki se ukvarja s tem je lipodomika, ki preučuje metabolne poti lipidov in njihove strukture. Pri dalj živečih organizmih so strukturni lipidi v nasičenem stanju, lipidi v energijskih zalogah pa v nenasičenem stanju.

== Vivian Nemanič: VPLIV STRESA IN GLUKOKORTIKOIDOV NA PRENOS GLUTAMATA ==
Stres lahko opišemo kot nespecifičen odziv telesa na nek stresor, ki je lahko dogodek ali izkušnja, ki onemogoči posamezniku, da se bi odzval. Akuten in kroničen stres in s stresom povezana sprostitev glukokortikoidov lahko sproži spremembe v prefrontalnemu korteksu in v hipokampusu, saj povzroča spremembe v glutamatnih nevrotransmitorjih. Stres tudi dokazano povzroča kompleksne strukturne spremembe v različnih možganskih regijah. Glede na glutamatergično sinapso, ima lahko stres vpliv na plastičnost in sicer v pozitivnem smislu, da izboljša delovanje možganov, ali pa v slabem smislu, ko lahko vodi do psiholoških motenj. Vemo tudi to, da so s stresom povezane spremembe v različnih aspektih povezane z nevrotransmisijo oz. prenosom glutamata in z vlogo glukokortikoidov. Akutni stres ima generalni učinek na povečanje glutamatergične nevrotransmisije v prefrontalnem korteksu in drugih regijah, ki so povezane s spominom in učenjem ter vpliv na genimočne in negenomične spremembe na različnih straneh tridelne sinapse. Presinaptično sproščanje glutamata je povečano, če sodelujejo mineralokortikoidni in glukokortikoidni receptorji, saj ga oni regulirajo. Na postsinaptični strani akutni stres poveča ekspresijo in gostoto ionotropnih glutamat receptorjev (NDMA), kar vodi v sinaptično potenciranje. V nedavnih raziskavah poskušajo razumeti kako bi lahko mehanizmi, ki kontrolirajo funkcije glutamatne sinapse, lahko pomagali pri razvoju zdravil za različne duševne motnje.

== Lena Trnovec: KARBAMOILACIJA: MEHANIZMI IN POSLEDICE ==
Sečnina že več desetletij velja za relativno nestrupeno spojino. Že nekaj časa pa se nabirajo dokazi, ki podpirajo dejstvo, da post-translacijska modifikacija karbamoilacija, ki je neločljivo povezana s kopičenjem sečnine in odpovedjo ledvic, pripelje do mnogih bioloških in kliničnih posledic. Karbamoilacija proteinov je neencimska post-translacijska modifikacija, ki veže prosto aminsko skupino mnogih proteinov z izociansko kislino. Ta nastane pri disociaciji sečnine ali iz tiocianata, katerega razgradnjo usmerjajo mieloperoksidaze. Glede na vrsto spremenjene molekule (na primer kolagen, albumin, lipoprotein z nizko gostoto ali lipoprotein z visoko gostoto), ima karbamoilacija različne patofiziološke učinke. Karbamoilirani proteini naj bi bili povezani z aterosklerozo, presnovo maščob, motnjami imunskega sistema (kot je inhibicija klasične poti aktivacije komplementa, inhibicija od komplementa odvisne celične citotoksičnosti rituksimaba, zmanjšan oksidativni izbruh nevtrofilcev) in fibrozo jeter. Tako v in vitro kot in vivo raziskavah ima karbamoilacija škodljive posledice na vseh nivojih fiziologije, njena povezava z vnetjem in uremijo pa razsvetli faktorje tveganja pri bolnikih s kronično odpovedjo ledvic. Zmanjšanje stopnje karbamoilacije bi tako lahko bil zanimiv terapevtski pristop k zmanjšanju posledic bolezni ledvic. Obstaja mnogo možnosti za zmanjšanje stopnje karbamoilacije – prehranjevalni pristop (aminokislinska dopolnila), prilagoditev dialize in protivnetne terapije.

== Ana Vičič: VLOGA MITOHONDRIJA V TOKSIČNEM OKSIDATIVNEM STRESU ==
Do oksidativnega stresa v mitohondrijih pride, ko koncentracija oksidativnih zvrsti preseže kapaciteto mitohondrijskih antioksidativnih sistemov. V dihalni verigi nastajajo zelo reaktivni ROS-i, ki hitro po nastanku reagirajo z bližnjimi biološkimi makromolekulami in jih pri tem poškodujejo. Ker so biološke makromolekule, kot so mtDNA, kardiolipin, akonitaza, in UCP2, ključne za pravilno delovanje celice, imajo njihove poškodbe velike posledice, ki se lahko akumulirajo in nato odražajo v celični nekrozi in na nivoju človeškega organizma v nevrogenerativnih boleznih in staranju. Oksidacija mtDNA lahko vodi do napak v genskem zapisu za proteine in nukleinske kisline, ključne za delovanje celičnega dihanja. Oksidacija kardiolipina lahko sproži signalizacijo za celično apoptozo. ROS-i deaktivirajo encim akonitazo in s tem ovirajo potek Krebsovega cikla. Poleg tega se pri oksidaciji akonitaze sprostita Fe2+ in H2O2, ki tvorita proste nove proste radikale. ROS-i po mehanizmu ki še ni jasen, povzročajo razklop dihalne verige in sinteze ATP, torej tudi na ta način ovirajo energijski metabolizem celice. Zato da bi zmanjšali oksidativni stres v mitohondrijih, bi lahko vanje dodajali encimske ali ne encimske, naravne ali sintetične antioksidante. Ti zmanjšujejo koncentracijo ROS-ov v mitohondrijih in s tem zaščitijo pomembne biološke makromolekule. S tem, ko bi z antioksidanti povečali odpornost mitohondrija na oksidativni stres, bi zaščitili celico in celoten organizem.

== Maja Trifkovič: VPLIV MUTACIJ MITOHONDRIJSKE DNA NA DELOVANJE CELIC ==
Najpomembnejša naloga mitohondrijev je sintetiziranje ATP, ki ga celice potrebujejo za različne procese. Večina tega ATP se sintetizira pri procesu oksidativne fosforilacije, ki poteka s pomočjo proteinskih kompleksov na notranji membrani mitohondrija. Proteini, ki sestavljajo te komplekse, so kodirani tako z jedrno, kot tudi mitohondrijsko DNA (mtDNA). Ta je krožna in dvoverižna, poleg genov za že omenjenih 13 proteinov pa vsebuje še gene za 22 molekul tRNA in 2 molekuli rRNA. Najpogosteje mutacije mtDNA povzročijo nepravilnosti v zgradbi in delovanju enega izmed kompleksov elektronske prenašalne verige ali ATP sintaze, zaradi česar se sintetizira manj ATP, poveča koncentracija reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) in spremeni struktura mitohondrijev. Takšne spremembe najbolj vplivajo na celice, ki potrebujejo več energije (npr. mišične in živčne celice). Nekatere mutacije mtDNA se pojavijo pogosteje kot druge in povzročijo mitohondrijske bolezni, kot so na primer MELAS, MERRF, LHON, NARP in KSS, ki se večinoma izrazijo kot motnje v delovanju mišic (predvsem mišic oči in vek ali nenadzorovani gibi skeletnih mišic) ali živčnega sistema (največkrat optičnih živcev). Čeprav so bile številne mitohondrijske bolezni in mutacije, ki jih povzročajo, odkrite že pred nekaj časa in bile predmet številnih raziskav, nekaterih mehanizmov in posledic še ni mogoče natančno razložiti, prav tako za večino bolezni še ne poznamo zdravila.

== Anja Konjc: SUPERKOMPLEKSI ==
Elektronska prenašalna veriga je sestavljena iz petih kompleksov. Ti kompleksi se med seboj lahko združujejo v organizirane enote višjega reda, ki jim pravimo superkompleksi. Sestavljanje le-teh poteka v točno določenem vrstnem redu. Najprej se morajo namreč izgraditi posamezni kompleksi, šele potem lahko pride do njihovega združevanja. Pri tem sodelujejo posebni proteini (''ang''. »assembly factors«), ki imajo pomembno vlogo tudi pri stabilizaciji superkompleksov. Obstajata dve poti združitve kompleksov v superkomplekse. Razlikujeta se v vrstnem redu dodajanja podenot in po proteinih, ki pomagajo pri združevanju kompleksov. Še vedno ni čisto jasno, kaj je glavni razlog za nastanek superkompleksov, vendar se predvideva, da ima združevanje kompleksov več pozitivnih posledic. Tvorba superkompleksov naj bi izboljšala transport elektronov preko usmerjanja substrata. Poleg tega naj bi superkompleksi pomagali pri zmanjšanju proizvodnje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Povezovanje v superkomplekse naj bi vplivalo tudi na komplekse same, saj bi se tako povečala stabilnost posameznih kompleksov. Med podenotami namreč obstajajo številne nekovalentne interakcije, kot je solni most. Proteini, ki pomagajo pri izgradnji kompleksov so povezani tudi s številnimi boleznimi. Če namreč pride do napak pri izgradnji posameznih kompleksov, to vpliva na potek oksidativne fosforilacije.

== Tim Nograsek: TIOREDOKSINI IN NJIHOVA VLOGA PRI FOTOSINTEZI IN BIOSINTEZI ŠKROBA ==
Tioredoksini so proteini, ki vsebujejo na aktivnem mestu dve aminokislini in sicer dva cisteina. Njihova vloga je regulacija in aktivacija različnih encimov v celici. To jim omogoča zmožnost prehajanja cisteinov iz enega redoks stanja v drugega. Ko so reducirani imajo dve tiolni skupini (-SH), v reduciranem stanju pa oddajo dva elektrona in protona in pri tem vzpostavijo sulfidno vez med atomoma žvepla. Encime, ki sodelujejo pri Calvinovem ciklu, biosintezi škroba (AGPaza), sintezi malata in še drugi ob vezavi tioredoksinov prevzamejo njihove elektrone in pri tem pride do komformacijske spremembe, ki se odraža kot aktivnost encima in večja afiniteta za vezavo substratov. Obnavljajo se lahko preko feredoskina, kjer prejmejo elektrone iz elektronske trasnportne verige, lahko pa tudi s pomočjo molekule NADPH, ki odda svoje elektrone tioredoskinom in se ob tem sama oksidira. Trenutno so znanstveniki odkrili ževeliko različnih izoformov tioredoksinov, ki se med seboj razlikujejo po tipu naloge, ki jo opravljajo. Tako lahko najdemo v kloroplastu najpomembnejša izoforma - tioredoksin f in tioredoksin m. Tioredoksini so povečini odvisni od svetlobe, ki je vir elektronov zanje, obstaja pa tudiposeben tip NADP-Trx reduktaza NTRC, ki vsebuje tako NADP-Trx reduktazo kot Trx funkcionalno skupino na enojnem polipeptidu in je zmožna kontrole biosinteze škroba tudi v temi oziroma ob slabših svetlobnih pogojih.

==Maja Mahorič: POTI FIKSACIJE OGLJIKA PRI AVTOTROFIH ==
Organizme glede na vir ogljika delimo na heterotrofe in avtotrofe. Hererotrofi ogljik pridobivajo iz organskih spojin, medtem ko imajo avtotrofi zmožnost fiksacije anorganskega ogljika, ki se nahaja v obliki ogljikovega dioksida v zraku in hidrogenkarbonatnih ionov v vodi. Ti organizmi skupaj omogočajo kroženje ogljika in s tem življenje na Zemlji. Najbolj razširjena pot je Calvinov cikel, razširjen med rastlinami, algami in cianobakterijami, ki je dolgo veljal za edino pot fiksacije ogljika. Med bakterijami in arhejami pa danes poznamo še pet drugih poti fiksacije. Razširjene so med kemolitoavtotrofih, ki živijo v ekstremnih okoljih in so temu primerno prilagojeni. Preučevanje teh poti, njihovih encimov in intermediatov nam daje vpogled v razvoj prvih organizmov na Zemlji ter v razvoj in delitev bakterij in arhej. Te poti so rTCA (cikel citronske kisline, kjer potekajo reakcije redukcije), Wood-Ljungdahlova pot, 3-hidroksipropionatni bicikel, 3-hidroksipropionatni/4-hidroksibutiratni cikel in dikarboksilatni/4-hidroksibutiratni cikel. Končna produkta teh poti sta acetil-CoA in piruvat, ki sta prekurzorja za biosintezo ogljikovih hidratov. Poti fiksacije ogljika, ki potekajo v aerobnih pogojih in tolerirajo kisik praviloma porabijo več energije za njuno sintezo v primerjavi z energijsko učinkovitejšimi potmi, ki pa so občutljive na kisik in morajo zato potekati v anaerobnih okoljih.

==Nina Varda: BIOSINTEZA LEVKOTRIENA B4 ==
Levkotrien B4 (LTB4) je lipidni vnetni mediator, ki spada med eikozanoide. Sintetizirajo ga levkociti, mast celice in makrofagi. Spodbuja migracijo levkocitov v vnetno tkivo, podaljšuje vnetni odziv in poveča fagocitozo. Iz arahidonske kisline nastane v treh korakih. Prva dva koraka (nastanek 5-hidroperoksieikozatetraenojske kisline, nastanek levkotriena A4 (LTA4)) katalizira encim 5-lipoksigenaza (5-LOX). Ta za svoje delovanje potrebuje 5-lipoksigenaza aktivirajoči protein (FLAP). Zadnji korak pa katalizira LTA4 hidrolaza (LTA4H). Za to reakcijo sta predlagana dva možna mehanizma, ni pa še znano po katerem poteče. Poleg sinteze LTB4 ima LTA4H tudi peptidazno aktivnost. Tako kot ostali eikozanoidi, se tudi LTB4 lahko sintetizira transcelularno . Torej en del biosinteze poteče v prvi celici, po prenosu intermediata pa v drugi celici poteče še preostali del biosinteze. Če se LTB4 sintetizira v presežku lahko povzroči patogenezo in vzdržuje kronične vnetne bolezni (artritis, kronična obstruktivna pljučna bolezen, srčnožilne bolezni, rak, metabolna bolezen). Zato poteka razvoj inhibitorjev, ki pa so zaenkrat večinoma še neselektivni in slabo učinkoviti. Preko odsotnosti genov za proteine biosinteze LTB4 se opazuje fiziološki pomen LTB4. Na tak način so potrdili, da je LTB4 ključen pri nastanku alergičnega vnetja kože, zbiranju nevtrofilcev in povzročitvi povečanega pritiska v dihalnih poteh.

==Timotej Zgonik: NADZOR HOMEOSTAZE LIPIDDNEGA DVOSLOJA ==
Mehanizme regulacije sestave bioloških membran v splošnem poznamo relativno slabo, kljub njihovi ključni funkciji za žive organizme. V bakterijah so ugotovili, da transmembranski kompleks DesK zaznava spremembe v debelini plazmaleme v odvisnosti od temperature, na kar se v primeru prekomerne rigidnosti zaradi mraza odziva s promocijo transkripcije gena za encim, ki katalizira pretvorbo maščobnih kislin iz nasičenih v nenasičene, da se membrana vrne v bolj fluidno stanje. Osnova za ta odziv je najverjetneje posledica skrčenja membranskega dvosloja, kar povzroči destabilizacijo transmembranskih verig proteina, to pa ga aktivira. V evkariontih različni proteini zaznavajo različne lastnosti membran, med drugim se s faktorjem MGA2 regulira količina nenasičenih maščobnih kislin v membrani endoplazemskega retikuluma po skoraj enakem mehanizmu kot pri prej omenjenem DesK, le da tu ne gre za zaznavanje spremembe debeline dvosloja, ali pa PAQR-2, katerega analogi so znani tudi pri sesalcih, zanj pa je bilo ugotovljeno, da v kompleksu lahko regulira prehajanje hidroliznih substratov in produktov skozi membrano kot odziv na povečanje rigidnosti. Slednji bi lahko bil zanimiv, saj je bilo ugotovljeno, da tako nastali lipidi lahko potujejo iz celice in stabilizirajo tudi sosednje membrane.

==Tina Arnšek: REGULACIJA SINTEZE LIPIDOV NA MEMBRANI ENDOPLAZEMSKEGA RETIKULUMA S FOSFATIDATOM ==
V kvasovkah in drugih višjih evkariontih so fosfolipidi in triacilgliceroli sintetizirani iz fosfatidata (PA). Fosfatidne kisline oz. fosfatidat so fosfolipidi, kjer ob hidrolizi nastane ena molekula glicerola, dve molekuli maščobnih kislin in anorganski fosfat. Poleg tega, da je prekurzor pri sintezi lipidov, pa je fosfatidat tudi regulatorna molekula v transkripcijski kontroli genov za sintezo fosfolipidov. Pri regulaciji koncentracije fosfatidata na membrani ER sta ključna encima Pah1 fosfatidat fosfataza (PAP) in Dkg1 diacilglicerol (DAG) kinaza, ki imata ravno obratno vlogo - Pah1 PAP defosforilira PA, da nastane diacilglicerol (DAG), Dkg1 DAG kinaza pa fosforilira DAG, da nastane PA. Neaktivnost Pah1 fosfatidat fosfataze (pah1Δ mutacija) vpliva na sintezo triacilglicerolov ter ravnovesje koncentracije fosfatidata, kar spremeni sintezo lipidov in z njimi povezanih celičnih defektov, kot so povečanje ER membrane zaradi povečane sinteze fosfolipidov, lipotoksičnost in zmanjšano število lipidnih kapljic. Lokalizacija in aktivnost encimov Pah1 fosfatidat fosfataza in Dkg1 DAG kinaza pa je regulirana s fosforilacijo oz. defosforilacijo.

== Sašo Jakob: Vpliv metabolizma aminokislin na imunski sistem ==
Metabolizem aminokislin je zapleten in zelo reguliran proces. Kot gradniki proteinov, so aminokisline zelo pomembne v vseh procesih, ki potekajo v organizmih. Pomembno vlogo imajo tudi pri regulaciji imunskega odziva. Njihova prisotnost ali aktivnost njihovega katabolnega encima lahko vpliva na izražanje drugih proteinov in na proliferacijo celic imunskega sistema, kot so T-celice. Najbolj sem opisal vpliv metabolizma L- triptofana in L- arginina na imunski sistem. Prvi korak pri katabolizmu L- triptofana katalizirata IDO ali TDO. S svojim delovanjem lahko na različne načine spreminjata delovanje imunskega sistema (na številčnost T-celic, na imunotoleranco).Pri katabolizmu L-arginina sta najpomembnajša encima arginaza in sintaza dušikovega oksida. Tudi njuno delovanje lahko negativno vpliva na delovanje T-celic in še na druge sisteme imunskega sistema. Tudi metabolizem drugih aminokislin vpliva na imunski sistem. Inhibitorji katabolnih encimov aminokislin (npr. IDO, NOS, ARG) imajo potencial za terapijo pri pacientih z rakom, še vedno pa je povezava med imunostjo in metabolizmom aminokislin precej neraziskana tema.

== Tina Logonder: SERIN V RASTLINAH ==
L-serin je aminokislina, ki ni pomebna le kot gradnik proteinov, temveč je vpletena tudi v mnoge metabolne poti v celici in predstavlja prekurzor številnih bioloških molekul. Razumevanje homeostaze serina pri rastlinah je oteženo zaradi prisotnosti treh različnih sinteznih poti. Do nedavnega je za najpomembnejšo veljala fotorespiratorna glikolatna pot, ostali dve nefotorespiratorni poti (PPBS in gliceratna) pa sta bili zanemarjeni. Funkcionalni pomen gliceratne poti je še vedno nepoznan. Napredki pa so pokazali na izreden pomen PPSB poti. Rastline z okvarjeno PPSB potjo kažejo motnje v razvoju zarodka, moških gametofitov in korenin. Rastline ob zadostni koncentraciji kisika in prisotnosti svetlobe v fotosintetskih celicah, ki imajo fukcionalne kloroplaste, sintetizirajo L-serin in ga preko floema transportirajo do nefotosintetskih organov, kot so korenine, žile, prašniki in pestiči. Glikolatna pot je pomembna, saj za sintezo serina porabi glicerin, ki je rezultat razgradnje strupenega fosfoglicerata. Ta nastaja, ko encim RuBisCO kot substrat porablja kisik. PPSB pot pa je pomembna za sintezo serina v celicah, ki ne vršijo fotorespiracije, imajo odsotne ustrezne transporterje za prenos serina preko plazmaleme ali so preveč oddaljene od žilnega sistema. Encimi PPSB poti pa se aktivirajo tudi v fotosintetskih tkivih, in sicer ponoči ter ob visoki, koncentraciji ogljikovega dioksida, ki onemogoči potek fotorespiracije.

== Marjeta Milostnik: Biologija hema v eritroidnih celicah sesalcev ter povezane bolezni ==
Hem je prostetična skupina, sestavljena iz protoporfirina IX z vključenim železovim (Fe2+) ionom. Je komponenta hemoproteinov, proteinov, ki imajo kot prostetično skupino vgrajen hem. Med nje sodijo hemoglobin, mioglobin, citokromi in encim katalaza. Biosinteza hema v celicah sesalcev je proces, ki vključuje 8 encimov. V eritroidnih in ostalih (neeritroidnih) celicah v organizmu je proces sinteze hema drugačen. V seminarju sem se osredotočila na biosintezo hema v eritroidnih celicah. Prva stopnja sinteze je nastanek δ-aminolevulinske kisline (ALA) iz glicina in sukcinat-CoA s kondenzacijo. Ta reakcija poteče v matriksu mitohondrija, katalizira pa jo encim ALAS (ALA sintaza) Vmesni intermediati se sintetizirajo v citosolu celice. Biosinteza hema se zaključi v matriksu mitohondrija z encimom ferokelatazo (FECH), ki v molekulo protoporfirina vgradi železov ion. Hem ima poleg vloge prenašanja in shranjevanja kisika v telesu tudi regulatorno vlogo v bioloških procesih med eritropoezo (proces zorenja eritrocitov). Motnje v biosintezi hema v procesu razvoja eritroblastov vodijo lahko do bolezni npr. sideroblastne anemije, prav tako pa lahko genetske napake v biosintezi hema vodijo do akumulacije intermediatov biosinteze, ki povzročijo bolezni znane pod skupnim imenom porfirije. V seminarju sem kot primer bolezni, ki se pojavijo pri nepravilni biosintezi hema opisala sideroblastno anemijo in eritropoetsko porfirijo, natančneje njene podzvrsti eritropoetsko protoporfirijo in kongenitalno eritropoetsko porfirijo ter predlagane načine zdravljenja teh bolezni.

== Žan Fortuna: Grelin: Struktura in funkcija ==
Somatotropin je rastni hormon, ki se izloča iz prednjega režnja hipofize. Ima zelo pomembno vlogo, saj vpliva na rast razvoj in obnovo vseh telesnih tkiv prav tako pa tudi vpliva na metabolizem beljakovin, maščob in ogljikovih hidratov. Grelin je peptidni hormon, ki je bil odkrit kot ligand, ki se veže na receptor GHS (growth hormone secretagogue). Ob izražanju gena za grelin nastane najprej preprogrelin, ki se nato s cepitvijo vezi pretvori v neaktivno obliko grelina in C-grelin iz katerega nastane obestatin. Nastanek aktivne oblike grelina katalizira encim grelin-O-acil transferaza, ki pripaja na serin na položaju 3 iz N-terminalnega konca oktanoilno skupino. Največ ga nastaja v želodnih celicah nekaj pa tudi v hipotalamusu, trebušni slinavki in drugih. Njegove koncentracije so najvišje tik pred obrokom in se nato močno zmanjšajo. Najbolj poznana sta dva receptorja na katera se veže grelin; GHS-R1A in GHS-R1B. Prvi ima večjo vlogo saj deluje kot mesto vezave za grelin pri stimuliranju izločanja rastnega hormona. Prav tako pa je njegova pomembna naloga povečevanje apetita, do katere lahko pride po več signalizacijskih poteh.

BIO2 Seminar 2019

2020-01-03T12:07:26Z

Zan Fortuna 69: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Special:UserLogout&returnto=BIO2_Seminar_2019
! Nika Vegelj
| 12 || Formacija biofilma v povezavi s c-di-GMP signalizacijo. || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || TLR signalizacija in njena vloga pri revmatičnih boleznih || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Biokemijska logika glikolize] || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || Vpliv dimetil fumarata na GAPDH in aerobno glikolizo pri modulaciji imunosti || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze in laktata v možganih || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || Intermediati cikla citronske kisline: signalne molekule pod krinko || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 ||GPR91: Premikanje meja intermediatov Krebsovega cikla || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah pri aerobni vadbi] || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || Dobre stare maščobe: Povezava med signalizacijo lipidov in življenjsko dobo || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Večdimenzionalna vloga ketonskih teles] || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vpliv stresa in glukokortikoidov na prenos glutamata] || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || Karbamoilacija: mehanizmi in posledice || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
| Maja Trifkovič || 19 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vpliv mutacij mitohondrijske DNA na delovanje celic] || Ana Babnik || Maja Kolar || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Anja Konjc || 19 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Superkompleksi] || Maša Andoljšek || Jure Povšin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Ana Vičič || 19 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vloga mitohondrijev pri oksidativnem stresu] || Nastja Feguš || Manca Osolin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Andrej Špenko || 20 || || Vivian Nemanič || Greta Junger || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Maja Mahorič || 20 || Poti fiksacije ogljika pri avtotrofih || Lena Trnovec || Oskar Nemec || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Tim Nograšek || 20 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Tioredoksini in njihov vpliv pri fotosintezi in biosintezi ogljikovih hidratov ] ||| Sonja Gabrijelčič || Teo Nograšek || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Nina Varda || 21 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019#Nina_Varda:_BIOSINTEZA_LEVKOTRIENA_B4 Biosinteza levkotriena B4] || Maja Trifkovič || Ana Babnik || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Tina Arnšek || 21 || Regulacija sinteze lipidov s fosfatidatom || Anja Konjc || Maša Andoljšek || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Timotej Zgonik || 21 || Nadzor homeostaze lipidnega dvosloja || Ana Vičič || Nastja Feguš || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Sašo Jakob || 22 || Nadzor imunskega odziva z metabolizmom aminokislin || Andrej Špenko || Vivian Nemanič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Marjeta Milostnik || 22 || || Maja Mahorič || Lena Trnovec || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Tina Logonder || 22 || Serin v rastlinah || Tim Nograšek || Sonja Gabrijelčič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Žan Fortuna || 23 || Grelin: Struktura in funkcija || Nina Varda || Maja Trifkovič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Michelle Oletič || 23 || || Tina Arnšek || Anja Konjc || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Maša Gabrič || 23 || Serotonin || Timotej Zgonik || Ana Vičič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2019|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2019 Povzetki seminarjev

2019-04-09T14:47:30Z

Zan Fortuna 69:

=== Sašo Jakob: Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ===
Messenger RNA (mRNA) lahko v znanosti uporabimo tako, da jo vstavimo v žive celice, ki lahko sintetizirajo proteine glede na kodiran zapis v njej. Na ta način lahko sintetiziramo proteine za različne namene, eden pomembnejših je zdravljenje bolezni. V primeru respiratornih bolezni, je administracija zdravil (proteinov) lokalno na pljučno tkivo omejena na zgornje dele dihal (sapnik in bronhiji). Zato so že dolgo v uporabi neinvazivna aerosolna zdravila, ki zdravilo enakomerno razdelijo po celotnem bronhijskem in alveolarnem epitelu. Možnosti uporabe aerosolne mRNA za indukcijo sinteze proteinov v pljučnem epitelu so raziskovali Patel in sodelavci. Na podlagi preteklih raziskav so izbrali nekaj molekul, ki bi lahko sodelovale pri dostavi mRNA do pljučnih celic. Teste so izvajali na različnih vrstah laboratorijskih miši. Po smrti so pregledali vse njihove organe in pri njih ugotavljali prisotnost molekul, ki so jih v tkivu pričakovali. Ugotovili so, da je hiperrazvejen PBAE v kompleksu z želeno mRNA najprimernejši način njene dostave do celic pljučnega epitela. Na koncu so s postopkom liofilizacije, kar je sušenje in zmrzovanje pri zelo nizkih temperaturah, dosegli tudi uporabno življenjsko dobo takšnih zmesi.

=== Maja Kolar: Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih ===
Nevroni spadajo med najbolj polarizirane celice v naravi. To jim omogoča oblikovanje različnih lokaliziranih struktur, kot so akson in dendriti. Možgansko skorjo sestavljajo kortikalni nevroni, v katerih se oblike mitohondrijev razlikujejo glede na lokacijo; v dendritih in somi so dolge, cevaste oblike, medtem ko so v izrastkih aksona veliko krajši in kroglasti. Majhnost aksonskih mitohondrijev je povezana predvsem s fizijo oz. binarno cepitvijo, ki poteka prek oligomerizacije Drp1 proteina iz skupine dinaminov zunanji membrani. Ker je Drp1 citoplazemski protein, se z mitohondrijsko zunanjo membrano veže prek 4 različnih receptorjev, nevroznanstveniki Univerze v Columbiji, Lewis in sodelavci, pa so raziskovali predvsem receptor MFF (ang. mitochondrial fission factor), saj je v kortikalnih nevronih najpogostejši. Ekspresijo MFF gena so Lewis in sodelavci zavirali prek uporabe shRNA (ang. short hairpin RNA) ki je umetno izdelan RNA in se uporablja za RNA posege pri zaviranju ekspresije tarčnih genov. Z raziskavo so dokazali, da MFF nima znatnega vpliva na membranski potencial mitohondrijev in na njihovo skupno sposobnost pridelave ATP, je pa z zmanjšanim delovanjem izrazito vplival na povečanje presinaptičnih mitohondrijev. To je povečalo mitohondrijsko sposobnost absorpcije Ca2+ ionov med nevrotransmisijo, kar je vodilo do zmanjšanega presinaptičnega citoplazemskega kopičenja Ca2+. Posledično se je zmanjšalo sproščanje nevrotransmitorjev v sinaptično špranjo, zmanjšala aksonska razvejanost v možganih in oslabila medsebojna povezanost nevronov.

=== Timotej Zgonik: Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način ===
Že dolgo časa v biokemiji obstaja problem, kako so iz akiralnih molekul nastali kiralni komplesksi, saj je pri eksperimentih vedno bilo treba dodati kiralni center, da so se ostale molekule pravilno zvile. Raziskovalci Tehnološkega inštituta v Georgiji so izvedli tri eksperimente, ki so demonstrirali tvorbo homokiralnih struktur iz akiralnih komponent. V prvem eksperimentu so pripravili raztopino triaminopirimidina (TAP) in 6-(2,4,6-triokso-1,3,5-triazinan-1-il)heksanojske kisline (CyCo6). Spojini sta se povezali v heksamerne rozete, te pa so se nalagale v stolpiče tako leve in desne kiralnosti. Ko so v drugem eksperimentu v raztopini zamenjali CyCo6 z analogno, a kiralno spojino, je bila kiralnost vseh posledično nastalih struktur enaka. Tudi če je bila le vsaka tisoča molekula CyCo6 zamenjana s kiralnim analogom, so bile strukture še vedno homokiralne. Enako je veljalo tudi, če sta bila v raztopini prisotna enantiomera obeh kiralnosti, a je bil eden v rahlem presežku. Pri tretjem poskusu so rezultate uspeli ponoviti tudi za organske spojine, ki bi na Zemlji lahko bile prisotne pred nastankom življenja, čeprav je bil pri tem bil učinek ojačitve kiralnosti šibkejši, enantiomerski presežek, potreben za homokiralnost, pa večji. Vendarle gre pri tem za prvi primer, ko so spontano nastali analogi nukleotidov povzročili tvorbo homokiralnih struktur.

=== Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano ===
Proteini in nukleinske kisline so ključne za delovanje živih organizmov. Zanje je značilno, da se zvijejo v posebne konformacije, ki določajo njihove funkcije. A načrt po katerem bi se makromolekule zvijale še ni bil odkrit. Tako se je razvilo področje raziskovanja foldamerov (sintetičnih oligomerov, ki se zvijajo v sekundarne in terciarne strukture npr. v vijačnice in plošče). Otto in sodelavci so v svoji raziskavi predstavili kompleksno molekulo, ki lahko nastane spontano. Iz gradnika, ki ga sestavljata aminokislinska in adeninska podenota, so pridobili makrocikel iz 15 gradnikov. 15mer se je tako v kristalni obliki, kot tudi v raztopini zvil, zaradi nekovalentnih interakcij med gradniki. Najbolj opazen strukturni motiv je nalaganje aromatskih obročev v kupe (sekundarne strukture). Ena molekula se zvije v 5 kupov, pri čemer je vsak sestavljen iz treh fenilnih obročev in dveh adeninskih obročev. Ker so kupi med sabo orientirani, je prisotna tudi terciarna struktura. Pri nekaterih foldamerih so že bile odkrite katalitske in inhibitorne lastnosti. Ker so foldameri, ki so zaradi svoje terciarne zgradbe relativno kompleksni, sposobni spontanega nastanka, je možno, da so se pojavili in imeli pomembno vlogo že v zgodnjih fazah nastanka življenja.

===Anja Konjc: Nanodelci v boju proti raku===

Nanodelci postajajo čedalje pomembnejši pri razvoju zdravil, saj imajo določene posebnosti, ki omogočajo tarčno usmerjanje zdravil in zmanjševanje njihovih stranskih učinkov (npr. pri kemoterapiji). Vendar so predhodne raziskave pokazale določene pomanjkljivosti. S sintezo posebnega ščita, imenovanega proteinski koronski ščit (PCS), so raziskovalci rešili te omejitve. Ugotovili so namreč, da PCS zmanjša interakcije nanodelcev s serumskimi proteini in omogoči, da makrofagi teh delcev ne fagocitirajo. Tako nanodelci ostanejo več časa v krvi in prenesejo zdravila na ciljno mesto (npr. v tumorje). Nanodelci so namreč sposobni prenašati sorazmerno velike količine molekul (npr. zdravil), ki jih vstavimo v njihove pore. Znanstveniki so PCS sintetizirali tako, da so nanodelce prevlekli s posebnimi proteini. Obnašanje tako prevlečenih nanodelcev so opazovali z različnimi poskusi. Ko so mišim vbrizgali različne nanodelce, so ugotovili, da so se v tumorjih najbolj nakopičili tisti s PCS. To je dokazalo hipotezo, da lahko ti nanodelci uspešno prinesejo zdravila v tumorje, ne da bi pri tem prišlo do imunskega odziva, torej fagocitoze delcev. Zato bodo tudi v prihodnje nanodelci s PCS imeli pomembno vlogo pri zdravljenju različnih obolenj, ne le rakavih, saj povečujejo učinkovitost zdravljenja.

=== Oskar Nemec: Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr ===
Ustanovi Johns Hopkins Medicine in Sheppard Pratt Health System sta izvedli raziskavo, ki je pokazala, da imajo ljudje s shizofrenijo povečano količino protiteles proti virusu Epstein-Barr (VEB). Gre za herpesvirus, ki lahko povzroči infekcijsko mononukleozo. Za povečan imunski odziv je morda krivo dejstvo, da shizofrenija spremeni imunski sistem pacientov in jih naredi bolj občutljive na virus ali pa okužba poveča tveganje za izoblikovanje shizofrenije. Študijo so izvedli na 743 osebah - 432 je bilo obolelih za shizofrenijo, 311 pa jih je bilo zdravih. Najprej so izmerili količino protiteles proti komponentam virusa in primerjali količino protiteles med zdravo skupino in shizofreniki. Ugotovili so, da imajo shizofreniki od 1.7 do 2.3-krat večjo verjetnost, da imajo povečano količino protiteles proti VEB. Merili so tudi količino protiteles proti ostalim podobnim virusom, ampak pri shizofrenikih niso ugotovili odstopanja od zdrave skupine. Nato so proučevali DNA udeležencev ter ugotovili, da če ima dana oseba povečano količino protiteles proti VEB in tudi genetsko dovzetnost za shizofrenijo, je verjetnost da je ta oseba v skupini shizofrenikov osemkrat večja kot pa verjetnost, da je oseba zdrava. Ker ni pravih zdravil proti virusu, je pomembno, da odkrijejo, kako preprečiti delitev virusa. Povečano razumevanje delovanja infekcije z virusom VEB nam lahko morda pomaga pri zdravljenju shizofrenije.

=== Vivian Nemanič: Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo ===
Zdravila, ki jih uporabljamo za kemoterapijo, imajo veliko stranskih učinkov na naše telo. Da pa da zdravila delovala, so potrebne zelo velike količine, ki pa ne morejo ostati samo na tumorju oz. na prizadetem organu. V tej študiji so skušali ugotoviti kako bi preprečili, da zdravila zakrožijo po celem telesu in rešitev bi lahko bila absorpcijska naprava, ki bi nase vezala zdravilo iz krvi in tako pravzaprav absorbirala do 70% zdravila, ki ni ostalo v tumorju. To napravo bi izdelali s 3D tiskalnikom, zato da bi bila optimalne oblike in velikosti in bi se popolnoma prilegala žili. Eksperiment so izvedli na prašičih za primer jetrnega raka in bil je zelo uspešen. Verjetno bi absorpcijska naprava delovala tudi pri drugih vrstah raka in pri različnih zdravilih za kemoterapijo, poleg tega pa je pomembno da naprava ne ovira krvnega obtoka ali povzroče tromboze. Torej je varna za naše telo, saj naj ne bi imela nobenih negativnih učinkov na delovanje našega telesa, saj jo po približno eni uri po začetku kemoterapije vzamemo iz telesa, saj hitro opravi svojo nalogo. Naprava bi lahko postala zelo pomembna tudi pri odstranjevanju toksinov pri bakterijskih okužbah, okoljskih toksinov, ali pa tudi samih celic, ki bi jih ujeli na podlagi specifičnih kemijskih, fizikalnih ali bioloških značilnosti.

=== Kim Glavič: Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva ===
Zaradi nenehnega nastajanja poškodb DNA, ki jih povzročajo okoljski dejavniki, stranski produkti celičnega metabolizma ali pa kemoterapevtiki (npr. alkilirajoče snovi), so se razvili različni popravljalni mehanizmi, ki te napake popravljajo in skrbijo za zaščito zdravih tkiv. Eden takih mehanizmov je tudi popravljanje z izcepom baze (BER), ki v večini celic učinkovito odstrani napake. V nekaterih celicah, ki vsebujejo večje količine DNA-glikozilaze (AAG) pa njegova prevelika aktivnost povzroči kaskado dogodkov, kateri vodijo do celične smrti. Raziskovalci so ugotovili, da je povzročena degeneracija celic odvisna tako od količine AAG kot tudi od spola organizma ter, da sta pri propadanju teh celic prisotni dve vrsti celičnih smrti in sicer apoptoza (genetsko kontrolirana programirana celična smrt) ter nekroza (poteče kadar celica propade zaradi poškodbe). Pri slednji se med procesom propadanja izloča protein, ki posredno vpliva na nastanek vnetne reakcije torej prodiranja makrofagov na mesto propadajočih celic. TI makrofagi pa vplivajo na nastanek zelo reaktivnih kisikovih spojin, katere povzročijo še več poškodb DNA. Zaradi tega se aktivnost AAG še poveča, kar pa povzroči še večjo količino propadlih celic.

=== Ela Sabadin: Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miših ===
Znanstveniki so uspeli obnoviti sluh v odrasli miši modela DFNB9 gluhosti – motnja sluha, ki predstavlja enega najbolj pogostih primerov genetsko prirojene gluhosti. Posamezniki z DFNB9 so popolnoma gluhi in imajo pomanjkanje gena za kodiranje otoferlina (pri ljudeh je kodiran z otof genom), proteina, ki je bistven za prenašanje zvočnih informacij v slušno-senzoričnih sinapsah. Z injeciranjem tega gena v bolne miši, so znanstveniki uspešno obnovili funkcijo slušne sinapse in povrnili sluh na skoraj normalno stopnjo. Genska terapija na podlagi AAV (adeno-associated virus) je obetajoča terapevtska možnost za zdravljenje gluhosti, vendar je njena vloga omejena s potencialno ozkim terapevtskim oknom. Kakorkoli, ker je AAV omejil kapaciteto paketa DNA (približno 4,7 kilobaz), je zahtevno uporabiti to tehniko za gene, katerih regija kodiranja (cDNA) presega 5 kb, kot je na primer gen za kodiranje otoferlina, ki ima regijo kodiranja dolgo 6 kb. Znanstveniki so premagali to oviro s prilagajanjem AAV pristopa, znanega kot dvojna AAV strategija. Rezultati, doseženi s strani znanstvenikov, kažejo na to, da ja terapevtsko okno za prenos lokalnih genov pri pacientih z DFNB9 prirojeno gluhostjo lahko širše kot zgolj ideja in ponuja upe za razširitev teh ugotovitev na ostale tipe gluhosti.

=== Aleksandra Rauter: Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo ===
Črevesna flora je kompleksni mikrobni ekosistem v gastrointestinalnem traktu sesalcev. Vpliva na mnoge pomembne funkcije gostitelja, vpliva pa tudi na živčni sistem. V sami raziskavi so se osredotočili na rastne faktorje, ki vplivajo na celično delitev, proliferacijo. Zaradi odsotnosti rastnih faktorjev v umetnih medijih, je večina bakterij še negojenih, kar ovira naše razumevanje njihovih bioloških vlog. V študiji so z uporabo kokulture izolirali bakterijo KLE1738, ki je za svojo rast potrebovala prisotnost bakterije Bacteroides fragilis. Analiza supernatanta B. fragilis je vodila v izolacijo rastnega faktorja. To je bila GABA (Gamma AminoButyric Acid), ki je glavni nevrotransmiterski inhibitor v centralnem živčnem sistemu. Na podlagi spremenjenih vrednosti GABA v odvisnosti od antibiotikov in prisotnosti mikroorganizmov, so prišli do zaključka, da je črevesna flora posredno povezana tudi z različnimi boleznimi. Raziskali so, kako ševilčnost B. fragilis vpliva na nevronsko mrežo in povezavo med posameznimi regijami v možganih. Rezultati so pokazali, da zmanjšano število bakterij obratno korelira s funkcionalno povezavo med posameznimi možganskimi regijami. Prekrivanje teh z regijami limbičnega sistema je vplivalo na čustvene odizve. Z izolirano bakterijo KLE1738 niso našli nobene povezave. Dejstvo, da številčnost bakterij Bacteroides (in posledično vrednosti GABA) vpliva na fiziologijo možganskih regij, so potrdile tudi ostale študije. Raziskovalci so mnenja, da je to prvi korak k razumevanju te povezave.

=== Ana Babnik: Kako nas okuži določena vrsta bakterij? ===
Znano je, da Gram negativne bakterije v veziklih zunanje membrane transportirajo toksine, zaradi katerih zbolimo. O mehanizmu nastanku veziklov zunanje membrane se do sedaj ni vedelo veliko, predlaganih pa je bilo nekaj teorij biogeneze teh veziklov. Raziskovalcem iz Binghamton University v New Yorku je uspelo odkriti mehanizem, kako bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'' komunicirajo med sabo preko majhnih molekul ''Pseudomonas quinolone signal'' (PQS). Ta bakterija je pomembna, saj je predmet mnogih raziskav in pri živalih, rastlinah in ljudeh povzroča hude okužbe. Molekula PQS se preko več korakov vgradi v vrhnji sloj zunanje membrane, s tem asimetrično poveča membrano in povzroči uvihanje. Li in sodelavci so s simulacijami, pri katerih so približali molekulo na 1 nm (trajanje 300 ns ali 500 ns), dokazali, da pri tem delujejo močne vodikove vezi med fosfatno skupino membrane in funkcionalnimi skupinami PQS, ki pomagajo pri spontani umestitvi v membrano. Z meritvami minimalne razdalje med vrhnjim slojem in PQS, ki je znašal 1,35 nm, so potrdili izjemno stabilnost faze vezave molekule na površino. Odkrili pa so tudi spremembo iz odprte v zaprto konformacijo PQS, ki zmanjša odbojne sile pri penetraciji vrhnjega dela membrane. Sklepajo, da bi tak model komunikacije bakterij lahko obstajal še pri drugih vrstah Gram negativnih bakterij. Spoznanja raziskave pa prinašajo boljše razumevanje mehanizmov biogeneze membranskih veziklov, ki raziskovalcem pomagajo razumeti interakcije med več vrstami ter tako posledično iskati rešitve za preprečitev potencialnih okužb.

=== Karmen Ferjan: Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico ===
Glavni problem pri kliničnem prenosu siRNA v zdravilih je dostava v citosol. Mnogi polimeri so bili razviti za ta prenos siRNA, ampak noben hkrati ni ustrezal, bili so premalo učinkoviti ali pa preveč toksični. Članek objavljen v reviji ACS central Science poroča o preprosti strategiji za izgradnjo nanodelcev v obliki jedra z lupino, ki je zelo učinkovita za dostavo siRNA. Nanodelec je pripravljen z entropijsko-gnanim kompleksom siRNA in sestavine zelenega čaja EGCG, ter je obložen z polimeri nizke molekulske mase. Poskusi so bili izvedeni z šestimi različno razvejanimi naravnimi in sintetičnimi polimeri. Izdelan nanodelec je imenovan GNP (Green Nanoparticle). Ta strategija lajša polimerom zgoščevanje siRNA v enoten nanodelec, ki lažje dostopa v celico kot siRNA brez catechina. Zgoščevanje dokažemo z drugačno barvo fluresciranj v prisotnosti EtBr. Namen uporabe GNP je lajšanje bolezenskih stanj kot je na primer kronično črevesno vnetje. Poskusi uporabe so bili izvedeni na HeLa celicah ter na miših. EGCG je z antioksidantskimi, proti-vnetnimi, antibakterijskimi in proti-rakotvornimi učinki navdihujoč za lokalno zdravljenje različnih bolezni.

=== Maša Andoljšek: Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo ===
Poznamo diferenciacijo zrelih celic pri rastlinah, nekaterih živalih, manj pa pri sesalcih. Splošno velja, da človeške odrasle matične celice ne morejo spremeniti svoje funkcije. Raziskava je bila na temo plastičnosti, to pomeni spreminjanje naloge zrele celice. Raziskovali so, ali lahko celice alfa (proizvajalke glukagona) ali celice gama (proizvajalke pankreatičnega polipeptida), ki se nahajajo v Langerhansovih otočkih trebušne slinavke, spremenijo svojo funkcijo in začnejo proizvajati inzulin, kot celice beta. Raziskava je potekala in vitro, nato pa še in vivo, saj so psevdootočke, spremenjenih celic z transkripcijskimi faktorji(Pdx1, Mafa in Nkx6-1), transplantirali v miši. Sprva so celicam alfa dodali zeleni fluorescenčni protein in zgodilo se ni nič, nato so ob dodatku Pdx1 in Mafa začele proizvajati največ inzulina, ter tudi nekatere gene celic beta. Čez nekaj tednov so proizvajale le še inzulin. Potrdili so diferenciacijo celic alfa in gama in vitro. Prilagajanje je bilo s časom čedalje bolj uspešno. Celice alfa in vivo so postale uspešne proizvajalke inzulina in ob transplantaciji psevdodotočkov celic alfa zdravih donorjev so ozdravili diabetes pri miši. Ugotovili so, da so se celice hitreje spremenile in vivo, kot in vitro. Da bi ugotovitve te raziskave postale del zdravljenja je potrebno še veliko, bi pa lahko bilo to zdravljenje uspešnejše od zdravljenja diabetesa danes.

=== Nika Vegelj: Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV ===
Virus HIV spada v družino retrovirusov, njegov genom pa je sestavljen iz dveh enojnih vijačnic RNA. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to so CD4+ T celice. Problem virusa HIV je ta, da se ga telo ne more znebiti zgolj s tvorbo protiteles, saj ostane integriran v genomu obolelega. Okužba z virusom HIV nato sproži odmiranje celic, ter apoptozo neokuženih celic, ki pridejo v stik z okuženimi. Zmanjšanje števila CD4+ T limfocitov pa vodi do nezadostnega celično posredovanega imunskega odziva. Funkcionalno zdravilo za virus HIV zahteva, da si organizem ponovno zgradi imunski sistem. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to pa so CD4+ T limfociti. Ko virus okuži CD4+ T limfocite, se lahko aktivno deli, da proizvede čim več novih virusov ali pa gre v stanje mirovanja. Znanstveniki so z raziskavo prikazali, da stimulacija CD4 T limfocitov z anti - α4 β7 antitelesi lahko modulirajo količino cofilina in popravijo defekt migracije T limfocitov, ki ga je povzročila hiperaktivacija cofilina. Znanstveniki so torej s to raziskavo odkrili nove možnosti za testiranje novih terapevtikov, ki bi obnovili sistem za migracijo T celic ter repopulacijo tkiv za rekonstrukcijo imunskega sistema in posledično nadzora nad virusom.

=== Tevž Levstek: Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ===
Osnovno razumevanje razmnoževanja virusov domneva, da določen virus okuži eno celico, ki pa naprej proizvede nove viruse in tako nadaljuje z okužbo sosednjih celic. Obstajajo pa tudi drugačni, večdelni virusi. Tovrstni virusi ne vsebujejo vsega dednega zapisa v le eni kapsidi, ampak so segmenti dednega materiala razporejeni po virusni populaciji. Omenjeni segmenti navadno zapisujejo različne, zaključene enote genskega zapisa, raziskovalci pa so v tem primeru uporabili virus, ki je imel 8 genskih segmentov. Ker je zelo majhna možnost, da bi vseh osem segmentov okužilo isto celico, so raziskovalci preverili, ali ti med sabo pri vstopanju v celice kakor koli vplivajo, da bi se ta možnost povečala. Ugotovili so, da se to ne dogaja in da dejansko skoraj nobena celica ne dobi vseh virusovih segmentov. Nadalje so raziskali, ali se sploh lahko razmnožujejo virusi iz celice, ki nima vseh genskih segmentov. Pokazali so, da v celicah, ki imajo določen virusni segment, nimajo pa segmenta z geni za replikacijo, ta vseeno poteka. Pojavijo se tudi proteini, ki jih ne zapisuje segment v celici, ampak segment v sosednji celici. Čeprav direktno niso dokazali, da bi virusovi proteini potovali iz ene celice v drugo, je dokazano, da se nekako pojavijo v celicah, ki zanje ne vsebujejo genskega zapisa, če katera od celic poleg ta zapis vsebuje. To pomeni, da najverjetneje med okuženimi celicami poteka transport ali dovršenih proteinov ali pa molekul mRNA, ki te beljakovine zapisujejo.

=== Michelle Oletič: Naivni makrofagi ===
Plazminogen aktivator zaviralec-1 (PAI-1) ima pro-tumorigenično funkcijo preko pro-angiogene in anti-apoptotične aktivnosti. V novi študiji je DeClerckova ekipa pokazala, da rakaste celice uporabljajo PAI-1, da prelisičijo imunski sistem telesa v podporo raku. Raziskava Los Angelske otroške bolnišnice z Yves DeClerck načelu je bila namenjena dokazovanju, da PAI-1 spodbuja rekrutiranje in M2 polarizacijo monocitov oz. makrofagov prek različnih strukturnih domen. Eni od teh dveh sta njegova LRP1 interakcijska domena in uPA interakcijska domena, ki pospešuje polarizacijo makrofagov M2 in indukcijo aktivacijske poti avtokrinega interlevkina (IL) -6 / STAT3. Raziskava, ki je potekala in vivo na miših je pokazala zadovoljive rezultate, da je izražanje PAI-1 povezano s povečano tumorigenostjo, povečano prisotnostjo M2 makrofagov, višjimi nivoji IL-6 in povečano fosforilacijo STAT3 v makrofagih. Močne pozitivne povezave med ekspresijo PAI-1, IL-6 in CD163 (M2 marker) so bile ugotovljene tudi z analizo podatkov več kot 11.000 vzorcev bolnikov z različnimi vrstami rakov pri ljudeh. Ti podatki skupaj zagotavljajo dokaze za mehanizem, ki pojasnjuje pro-tumogerično dejavnost pri raku. Tako odkritje je izrednega pomena pri zdravljenju raka in velik prvi korak k načinu odkrivanja novih možnosti.

=== Ana Vičič: Zdravila naslednje generacije, ki bi ovirala prenos malarijskega parazita v komarje ===
Za razumevanje pristopa znanstvenikov k problemu malarije moramo vedeti, da se infekcijske celice malarijskega parazita P. falciparum, ki jih med ljudmi prenašajo Anopheles komarji, v komarje prvotno v neaktivni obliki prenesejo iz človeka. Če bi torej z določenimi substancami preprečili prenos parazita v komarje, bi s tem onemogočili raznašanje aktiviranega parazita v človeški populaciji. Delves, M. J. in sodelavci so v omenjeni raziskavi za izhodišče vzeli 'Global Health Chemical Diversity Library' (GHCDL), knjižnico 68 689 različnih spojin s proti-malarijskim potencialom. Za postopno oženje nabora spojin in končno identifikacijo najobetavnejših so uporabili številne kriterije in analize v vrstnem redu kot sledi; učinkovitost v majhnih koncentracijah, majhna citotoksičnost za človeške celice, biološka, kemijska in fenotipska analiza, ter dva in vivo testa. S temeljitim pregledom GHCDL so identificirali in analizirali številne obetavne spojine za blokiranje prenosa malarijskih parazitov v komarje. V ožjo selekcijo so sprejeli tri spojine, BPCA, DDD01245291 in DDD01035881. Nato so na podlagi rezultatov in vivo testov za najobetavnejšo spojino določili DDD01035881 in njene analoge, ki prav tako vsebujejo N-4HCS ogrodje.

=== Lena Trnovec: Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih. ===
Ko govorimo o dednosti in izražanju genov, imamo največkrat v mislih zaporedje nukleotidov v molekuli DNK in spremembe v njem. Vzroki za te spremembe so kompleksni molekularni mehanizmi, med katere spadajo tako kemične modifikacije molekul DNK in RNK kot tudi post-translacijske modifikacije histonov – proteinov, okoli katerih se ovija kromatin. V članku v reviji Nature znanstveniki iz Mount Sinai School of Medicine poročajo, da so histoni lahko modificirani s pomočjo serotonina – proteina, ki je znan predvsem po svoji ključni vlogi v uravnavanju aktivnosti nevronov.Serotonin (tudi 5-hidroksitriptamin ali 5-HT) je biogeni monoamin, ki ima v človeškem organizmu vlogo tkivnega hormona in živčnega prenašalca. Raziskava je razkrila, da serotonin lahko neposredno (brez receptorja) cilja na kromatin preko post-translacijske modifikacije, ki ji pravimo serotonilacija. Prišli so do ugotovitev, da transglutaminaza 2 serotonilira histon H3 na položaju Q5 takrat, ko je položaj K4 trimetiliran. Kombinacija teh dveh post-translacijskih modifikacij se imenuje H3K4me3Q5ser. Ker sta modificirani lizinski in glutaminski ostanek drug ob drugem, je možno, da je stabilnost teh dveh modifikacij soodvisna. Njuna bližina bi lahko tudi pomagala pri funkciji transkripcijskih faktorjev TFIID in posledično vplivala na gensko izražanje.

=== Marjeta Milostnik: Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem ===
Avtofagija je proces celične razgradnje, s katerim celica reciklira snovi, ki so odvečne ali poškodovane. Pri tem uporablja lizosomske encime in strukture imenovane avtofagosomi, ki v citoplazmi zajamejo material za razgradnjo in ga dostavijo lizosomom, s katerimi skupaj tvojijo avtofagosome. V predstavljeni raziskavi so prišli do spoznanja, da je delovanje avtofagije s starostjo vpada in s tem povezali povečanje količine proteina Rubicon v celici. Raziskava je pokazala novo vlogo Rubicona, ki je bil doslej znan le kot protein ki interagira z Beclin-1. Ugotovili so, da ima Rubicon ključno vlogo pri regulianju staranja. Z raziskovanjem na organizmih C. elegans, samicah sadne muhe in miših so odkrili, da znižanje Rubicona aktivira avtofagijo, čeprav še vedno ni jasno kako. Skladno s pričakovanji je aktiviranje avtofagije podaljšalo življenjsko dobo, nekje bolj, nekje manj učinkovito. Znižanje nivoja Rubicona je bilo najbolj učinkovito v nevronih (živčnih celicah), saj se je takrat najbolj povečala življenjska doba organizma. Rezultati na miših, skupaj z rezultati na črvih in muhah kažejo, da je znižanje Rubicona v nevronih dovolj, da izboljša starostne fenotipe v organizmih, v primeru C. elegans je znižanje Rubicona zmanjšalo kopičenje proteina v steni telesne mišice, kar je eden od znakov staranja.

===Matevž Drnovšek: Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših ===
Povečana poraba sladkih pijač je povezana z razširjanjem prekomerne debelosti po svetu, ki je izbruhnila v 80. letih prejšnjega stoletja . V povsem istem časovnem obdobju so znanstveniki zasledili povečanje pojavnosti kolorektalnega raka predvsem med mladimi in odraslimi srednjih let. Ti podatki kažejo na možno povezavo med debelostjo, razvojem kolorektalnega raka in pogostim uživanjem sladkih pijač. Dokazano je, da prekomerno uživanje sladkih pijač povzroča debelost. Debelost pa posledično povečuje tveganje za kolorektalnega raka, za katerim najbolj pogosto zbolevajo moški. Dva dejavnika, ki dokazano vplivata na pospešeno proliferacijo tumorjev sta debelost in presnovni sindrom. Do sedaj pa še ni bilo dokazano, da bi prekomerno uživanje sladkih pijač neposredno vplivalo na proliferacijo tumorjev v črevesju. To povezavo so poskušali znanstveniki odkriti in dokazati z raziskavo na miših, ki so jih hranili z mešanico glukoznega in fruktoznega sirupa.

===Maša Gabrič: Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo===
Cepiva so najbolj učinkovita metoda kontroliranja virusnih okužb. Dokaz za to je izkoreninjenje črnih koz, močno zmanjšanje okužb s poliovirusom, HPV (Human Papillomavirus), gripo… Poliomielitis ali otroška paraliza je močno nalezljiva bolezen, ki jo povzroča poliovirus in se danes pojavlja le še v redkih državah v razvoju. Trenutno sta v uporabi dve cepivi proti poliomielitisu, OPV (Oral Poliovirus Vaccine), ki je oralno cepivo in vsebuje oslabljen virus ter IPV (Inactivated Poiliovirus Vaccine), ki ga injiciramo v mišico in vsebuje deaktiviran virus. OPV je bil zelo priljubljen, ker omogoča lažji potek masovnih cepilnih akcij, ki jih izvajajo v državah v razvoj, saj ni potrebe po sterilnih iglah. Da bi izkoreninili otroško paralizo pa bomo morali OPV nadomestiti z IPV, saj ima ta v redkih primerih škodljiv, nasprotni učinek, paralizo, povezano s cepivom. IPV je lahko pri optimalni temperaturi (2 – 8°C) hranjeno do 4 leta, vendar pa formula ni stabilna pri temperaturah višjih od 8°C, kar močno otežuje njegovo prenašanje in shranjevanje. Znanstveniki so razvili cepivo, ki je ostalo stabilno po 4 tedenski inkubaciji pri 4, 25 in 40°C ter je induciralo močna nevtralizacijska protitelesa in polno zaščito prodi poliovirusu divjega tipa pri miši.

===Alliana Kolar: Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov===
Klinična depresija je najbolj prevladujoča psihiatrična motnja, za katero trpi vedno več ljudi. Zdravi se jo z različnimi antidepresivi, najpogosteje s selektivnim zaviralcem ponovnega privzema serotonina (SSRI - Selective Serotonin Reuptake Inhibitors), ki deluje tako, da uravnoteži nepravilno presnovo serotonina (5-HT), namreč to je vzrok ali posledica (to nam je zaenkrat še neznano) depresije. Ker se približno 30% pacientov ne odzove na te antidepresive, so znanstveniki hoteli ugotoviti, kaj je razlog za neučinkovitost zdravila. Po osmih tednih zdravljenja pacientov s SSRI, so s tehnologijo induciranih pluripotentnih matičnih celic generirali nevrone pacientov, ki se odzovejo na zdravila, pacientov ki se ne odzovejo na zdravila in popolnoma zdravih posameznikov. Rezultati so pokazali, da je v nevronih pacientov, ki se ne odzovejo na SSRI, v primerjavi z drugima dvema skupinama višja aktivnost delovanja, kar pomeni, da se serotonin hitreje presnavlja, to pa povzroča nižjo koncentracijo serotonina v nevronih. Razlog za hiperaktivnost nevronov je v večjem številu serotonergičnih receptorjev 5-HT7 in 5-HT2A, ki igrajo vlogo pri prenosu serotonina do encima, kjer se razgradi. Ta problem bi lahko rešili z vezavo antagonistov na receptorje, ki zasedejo njihovo mesto in posledično se serotonin ne more vezati nanje, kar ohranja višjo koncentracijo serotonina v nevronih.

===Laura Unuk: Kako HIV-1 protein zavira odgovore imunskega sistema===
HIV ali virus humane imunske pomanjkljivosti povzroča počasi napredujoče kronične bolezni z dolgo dobo inkubacije. Za uspeh zasluženi proteini Vif, Nef, Vpr in Vpu, saj vznemirijo nekatere prirojene imunske senzorje. Znanstveniki so v raziskavah ugotovili novo vlogo Vpu-ja in sicer sposobnost, da prepreči aktivacijo NF-κB. V tej študiji so tako pojasnili (1) globalni vpliv Vpu na izražanje gostiteljskega gena, (2) transkripcijske faktorje, ki jih je usmerila Vpu, in (3) vlogo protiukrepanja tetherina pri imunosupresivni aktivnosti Vpu. Imuno-fluorescenčna mikroskopija je pokazala, da je Vpu-posredovano zaviranje aktivnosti NF-κB povezana z zmanjšano jedrsko translokacijo p65. Z različnimi tehnikami in metodami so pokazali, da Vpu zavira transkripcijo množice NF-κB-inducibilnih gostiteljskih genov s ključnimi vlogami imunskih odgovorih in da Vpu zmanjša izražanje IFN-jev tipa I in drugih pro-vnetnih citokinov. Analiza posameznih genov je pokazala, da Vpu bistveno zmanjša ravni mRNA gostiteljskih restrikcijskih faktorjev. Te ugotovitve kažejo, da Vpu virusa HIV-1 izvaja široko imunsko-zaviralno aktivnost pri okuženih primarnih CD4 + T celicah.

===Jure Povšin: Vpliv položaja celice na njeno obnovo===
Iz preprostega vzorca tkiva rastline, kot je veja ali list, lahko zraste popolnoma nova rastlina. Nove tehnologije sekvenciranja so omogočile izvedbo analize transkriptoma na ravni ene celice, a večina teh metod izgubi informacijo o položaju celice, ki je ključna pri razumevanju regeneracije celic, saj si celice, ki se dotikajo, pošiljajo signale med seboj. Raziskovalci iz Nara Institute of Science and Technology (NAIST) so oblikovali metodo, s katero so lahko iz individualnih živih celic iz nepoškodovanega tkiva izvlekli jedro, ki je vsebovalo RNA, brez da bi ogrožali celične informacije o položaju.To metodo so poimenovali single cell-digital gene expression (1cell-DGE). To je neka vrsta enoceličnega RNA-sekvenciranja , ki uporablja mikromanipulacijo za ekstrahiranje vsebine posamezne žive celice v nepoškodovanem tkivu, medtem ko se zabeleži tudi informacija o njenem položaju. To metodo so uporabili na rastlini Physcomitrella patens. Raziskovalci so izrezali distalno polovico listov te rastline ter takoj po rezu in še enkrat po 24 urah izsesali jedro in okoliško citoplazmo iz posameznih celic listov, ki so se bile na mestu reza ter sintetizirali cDNA iz RNA . Analizirali so RNA iz 31 celic takoj po izrezu in 34 celic 24 ur kasneje. Skupaj je bilo ugotovljenih 6382 diferencialno izraženih genov, od katerih je bilo izraženih 2382 genov v vzorcih odvzetih po 0 urah in 4000 genov v vzorcih odvzetih po 24 urah.

===Žan Fortuna: Molekula, ki bi lahko odstranila virus hepatitisa C===
V zadnjih letih so bili sintetični peptidi obetavni cilji za razvoj zdravil, ki imajo nizke stranske učinke, so stroškovno učinkoviti in dovzetni za racionalno načrtovanje. Peptid Hecate je bil prvotno opisan kot močan bakterijski zaviralec in kasneje kot zdravilo proti raku s funkcijami, povezanimi z lastnostmi lipidne interakcije. Hepatitis C je bolezen, ki napada predvsem jetra in jo povzroča virus hepatitisa C. Virusi, kot je virus hepatitisa C (VHC), imajo življenjski cikel, ki je odvisen od lipidov in bi jih lahko Hecate prizadel na več načinov. Znanstveniki so spremenili strukturo peptida in so na njegovem N-koncu dodali različne radikale in tako spremljali njihove učinke na virus hepatitisa C in citotoksičnost. Hecate, konjugiran z galno kislino, je bil najučinkovitejši derivat peptida Hecate, ki je bil uspešen zaviralec v infekcijskem ciklu HCV. Najobetavnejši vidik pa je bil mehanizem delovanja GA-Hecate, ki je bil povezan z uravnoteženo medsebojno interakcijo lipidov z virusnimi ovojnicami in lipidnimi kapljicami. Ta peptid zavira tako prehod virusa v celico in njegov izhod iz nje, kot tudi zavira podvajanje virusne RNA v celici in izgradnjo snovi, potrebnih za njegovo pravilno delovanje.

TBK2019-seminar

2019-03-28T19:08:33Z

Zan Fortuna 69: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević||
Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212141409.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||Bakterijski genotoksin kolibaktin človeškega črevesa alkilira DNA.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180919083446.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||Kako nas okuži določena vrsta bakterij?||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213124350.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207173229.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||Naivni makrofagi||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181129142441.htm?fbclid=IwAR2x562KFLljGOmHD5T40KXBf6I2L72TpMpvVM0I3lNBckrVxXW3cXQG-vM||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190312123658.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190321141924.htm||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||Ključ do podaljšane življenske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111744.htm
||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143312.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||Snov, ki preprečuje malarijo pri komarjih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180918082059.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127092558.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||Kako HIV-1 protein zatira odgovore imunskega sistema||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190205102525.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||Hiperaktivne možganske celice bi lahko bile razlog za neučinkovitost antidepresivov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190131162500.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak||Merjenje napetosti celične membrane s fluorescenčnim proteinom ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/08/180827110828.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||Potencialno zdravljenje cistične fibroze z uporabo 'molekularne protetike' za manjkajoče pljučne beljakovine||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143248.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||Molekula, ki lahko odstrani virus hepatitisa C||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/12/181219142543.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||Spreminjanje odprtih ran v kožo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180905131831.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||Kako lahko mitohondrijski encim sproži celično smrt||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190314151623.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||New pill can deliver insulin through the stomach||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207142206.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||RNA-vezavni protein Pum2 je tarča v boju proti staranju||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190110141826.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2019 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.