De novo načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju

Povzeto po članku: K. Liu, Y. Zhang, K. Liu, Y. Zhao, B. Gao, X. Tao, M. Zhao, F. Q. Wang, D. Wei: De Novo Design of a Transcription Factor for a Progesterone Biosensor. Biosensors and Bioelectronics 2022, 203.

Uvod

Uporaba bioreporterskih bakterij omogoča zaznavo kemijskega signala, ki ga celica prek reporterskega proteina prevede v merljiv signal. Načrtovanje bakterij, ki zaznajo toksične snovi v okolju, velja za enega prvih uspehov na področju sintezne biologije. Z uporabo celičnih senzornih in regulatornih komponent, ki nastopajo v načrtovanem vezju, je tako mogoča detekcija tarčnih spojin v najrazličnejših vzorcih. Kljub velikemu potencialu je komercialno dostopnih le nekaj bakterijskih biosenzorjev, samo en pa je mednarodno akreditiran [1].

Progesteron je ključni regulator reproduktivnih funkcij, zato tudi spada med klasična hormonska zdravila in se v medicini že dolgo uporablja z namenom vzdrževanja nosečnosti. Poleg tega pa pri ljudeh v nizkih koncentracijah povzroča endokrinsko neravnovesje in povzroča akutne ali kronične zdravstvene težave [2]. Učinki progesterona so posledica vezave na jedrni progesteronski receptor (PR), ki spada v družino transkripcijskih regulatorjev [3]. Z razvojem področja sintezne biologije se je razširil tudi nabor genetskih komponent za uporabo v vezjih biosenzorjev. Takšne komponente so DNA-stikala, regulatorni in reporterski proteini [1]. Za uporabo v biosenzorjih, ki temeljijo na transkripciji pa so še posebej pomembni alosterični transkripcijski faktorji (TF), ki omogočijo odgovor celice na prisotnost tarčne komponente z aktivacijo transkripcije reporterskega gena. Iskanje naravnih TF, ki se specifično odzivajo na posamezno spojino, je kljub veliki naravni raznolikosti izjemno zahtevno [2].

Načrtovanje proteinov lahko olajša uporaba računskih metod, ki so trenutno še v razvoju. V članku je bila prvič predlagana strategija de novo načrtovanja TF s pomočjo metode molekulske dinamike (MD), kjer načrtovanje de novo trodomenskega proteina DLA za uporabo v biosenzorju temelji na konformacijski spremembi ligand vezavne domene (LBD) ob vezavi tarčne molekule na receptor. Ta konformacijska sprememba da proteinu DLA vlogo mikrostikala, ki tako nadzoruje izražanje reporterja v biosenzorju [2].

Modeliranje TF

Tridimenzionalno strukturo proteinov lahko določamo z uporabo rentgenske kristalografije, jedrske magnetne resonance (NMR) ter s teoretičnim napovedovanjem modelov strukture, kar nam omogoča razumevanje funkcije proteina. Atomi, ki biološke molekule sestavljajo pa so v resnici dinamični, kar bistveno vpliva na funkcijo molekule in njene interakcije. Simulacije molekulske dinamike napovejo premike posameznih atomov v proteinu v določenem časovnem intervalu na podlagi fizikalnih zakonov interatomskih interakcij. S to metodo lahko spremljamo konformacijske spremembe, vezavo ligandov in zvijanje proteinov. S simulacijami MD pa lahko tudi napovemo odgovor biološke molekule na uvedbo mutacij, razne modifikacije in tudi vezavo ali odstranitev liganda [4].

Uporaba

Avtorji članka so načrtovali de novo transkripcijski faktor DLA, ki je sestavljen iz treh domen: LexA, LBD (PR) in B42. Njegovo vlogo mikrostikala so raziskovali s simulacijami MD pri čemer so spremljali spremembe konformacije proteina ob vezavi progesterona. Zanimalo jih je predvsem skrajšanje razdalje med podenotama LexA in B42, od česar je odvisna transkripcijska aktivnost proteina [2].

S spletnim orodjem I-TASSER so na osnovi homologije zaporedja napovedali 5 modelov strukture proteina DLA ter za nadaljnjo analizo z MD izbrali najbolje ocenjen model. V izbrani model strukture so za analizo z MD vezali molekulo progesterona, model brez vezanega liganda pa uporabili za kontrolo. Simulacije molekulske dinamike so izvajali v programskem paketu GROMACS 2019.6 z ustreznimi nastavitvami v intervalu 100 ns [2].

Rezultati

Rezultat simulacij MD sta bili dve verjetni konformacijski stanji. Ob vezavi progesterona je prišlo do premika C-končnega ß-zavoja znotraj LBD, kar je povzročilo odklon domene B42 in dodatno sterično oviro za približanje N-terminalne domene LexA. V modelu strukture brez vezanega progesterona pa je prišlo do stabilizacije C-končnega ß-zavoja, kar je povzročilo premik domene B42 v notranjost strukture. Lega centrov geometrije obeh modelov struktur ob vzpostavitvi ravnotežja se razlikuje za 1.7-2.2 nm, kar nakazuje na približanje transkripcijskih domen LexA in B42 ob vezavi progesterona. Rezultat simulacij molekulske dinamike je tako potrdil vlogo konformacijske spremembe domene LBD kot mikrostikala za nadzor aktivnosti celotnega de novo proteina DLA [2].

Biosenzor na osnovi celice

Biosenzorji so naprave, ki z uporabo biološke komponente pridobijo informacijo o vsebnosti določene komponente v vzorcu. Biosenzorji na osnovi celice uporabljajo kot biološko komponento živo celico in so bili razviti s tehnologijo rekombinantne DNA. Celice so načrtovali na način, da se s sintezo reporterskega proteina odzovejo na prisotnost specifične spojine. Njihova glavna prednost je zmožnost detekcije tarčne komponente prek kompleksnejših procesov v katerih sodelujejo številni encimi [5].

Konstrukcija

S konstrukcijo biosenzorja so želeli ojačati šibek signal konformacijske spremembe LBD ob vezavi progesterona v merljiv signal. Za šasijo za izbrali kvasovke S. cerevisiae, saj so preproste za liofilizacijo, suh prah pa je nato primeren za dolgotrajno hrambo. Sestavili so ekspresijsko kaseto z močnim promotorjem ADH1, ki je vsebovala trodomenski DLA in jo vstavili v genom gostitelja v genski lokus Gal80. Kot reporter so uporabili zeleni fluorescentni protein (GFP) na način, da so vektor pESC z zapisom za GFP pod promotorjem CYC1 in terminatorjem vstavili v celico. Promotor CYC1 so prilagodili, da je vseboval prokariontsko DNA-vezavno mesto za LexA, ki je prokariontska DNA-vezavna domena. Izražanje GFP je bilo na ta način strogo regulirano s prisotnostjo progesterona [2].

Rezultati

Občutljivost biosenzorja so najprej preizkušali z merjenjem fluorescence v odvisnosti od časa z namenom določitve optimalnega čas detekcije za katerega se je izkazal čas 5 h. Ta čas so upoštevali tudi v nadaljevanju poskusov. Visoko občutljivost testa so pokazali z merjenjem fluorescence pri naraščajoči koncentraciji progesterona. Pri tem so biosenzorju za vezavo liganda določili EC50 = 132 μg/L ter spodnjo mejo detekcije 5 μg/L. Opazili so tudi strm padec fluorescence, ko je koncentracija progesterona presegla 80 mg/L, kar je posledica inhibitornega vpliva molekule na kvasovke [2]. Za raziskovanje specifičnosti biosenzorja so izbrali 9 steroidov s podobnimi strukturami progesteronu in merili odziv biosenzorja na visoko koncentracijo izbranih steroidov. Poleg progesterona so opazili tudi detekcijo androst-4-en-3,17-diona (AD1) in holesterola, ki pa je izginila pri nižji koncentraciji ustrezni intervalu delovanja biosenzorja [2].

Izboljšave biosenzorja

Z namenom dodatne izboljšave občutljivosti so optimizirali izražanje DLA v celici, saj je povišano izražanje DLA povezano z višjo občutljivostjo biosenzorja. Biosenzor P2 so konstruirali s promotorjem TEF1, zapis za DLA pa so še vedno vnesli v lokus Gal80. Biosenzor P3 pa je prav tako vseboval zapis za DLA pod promotorjem TEF1, le da so zapis v celico vnesli z vektorjem pTCL. Pri tem se je občutljivost izboljšala skoraj 5-krat pri P2 ter 206-krat pri P3. Kljub uspešni izboljšavi občutljivosti pa se je pri biosenzorju P3 zmanjšal interval delovanja ter povečala interferenca ozadja [2]. Za uporabo biosenzorja v klinični diagnostiki je zelo pomemben tudi kratek čas detekcije, ki je v primeru biosenzorja na osnovi celice povezan s hitrostjo transmembranskega transporta tarčne molekule. Čas detekcije so poskušali skrajšati s povečanjem hitrosti prehajanja molekul čez membrano, kar so dosegli z izpostavitvijo kvasovk natrijevemu dodecil sulfatu pri visokem pH, ki poškoduje celično membrano in s tem poveča njeno prepustnost. Na ta način so dosegli zmanjšanje časa do detekcije na 2,5 h [2].

Zaključek

Z modularno uporabo teoretičnih računskih metod so uspešno načrtovali DLA na osnovi konformacijske spremembe LBD, ki je služil kot aktivator transkripcije v biosenzorju ter s tem predstavili pomen in aplikativnost postopka za hiter razvoj novih biosenzorjev raznih analitov. Uspešna izdelava specifičnega in hitrega progesteronskega biosenzorja nakazuje na možnost uporabe v klinični diagnostiki, kjer je trenutno v uporabi imunodetekcija (ELISA). Ta metoda je sicer visoko občutljiva, ima široko območje detekcije in kratek čas detekcije, vendar je izdelava draga, ima slabo ponovljivost rezultatov in navzkrižno reaktivnost z ostalimi steroidnimi hormoni. Razvoj cenejših tehnik detekcije ima velik pomen predvsem za države v razvoju in paciente z nižjimi dohodki z namenom zmanjšanja finančnega bremena zdravstvene oskrbe [2].

Viri

[1] J. R. van der Meer, S. Belkin: Where Microbiology Meets Microengineering: Design and Applications of Reporter Bacteria. Nature Reviews Microbiology. June 2010, pp 511–522.

[2] K. Liu, Y. Zhang, K. Liu, Y. Zhao, B. Gao, X. Tao, M. Zhao, F. Q. Wang, D. Wei: De Novo Design of a Transcription Factor for a Progesterone Biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 2022, 203.

[3] K. M. Scarpin, J. D. Graham, P. A. Mote, C. L. Clarke: Progesterone Action in Human Tissues: Regulation by Progesterone Receptor (PR) Isoform Expression, Nuclear Positioning and Coregulator Expression. Nuclear receptor signaling. 2009.

[4] S. A. Hollingsworth, R. O. Dror: Molecular Dynamics Simulation for All. Neuron. Cell Press September 19, 2018, pp 1129–1143.

[5] K. Yagi: Applications of Whole-Cell Bacterial Sensors in Biotechnology and Environmental Science. Applied Microbiology and Biotechnology. January 2007, pp 1251–1258.