IN VIVO SAMOSESTAVLJENA siRNA KOT NAČIN KOMBINIRANEGA ZDRAVLJENJA ULCEROZNEGA KOLITISA

Povzeto po članku: Zhou, X. et al. In vivo self-assembled siRNA as a modality for combination therapy of ulcerative colitis. Nature Communications. 13:5700 (2022).

UVOD

Zaradi kompleksne narave ulceroznega kolitisa se zdravniki in znanstveniki vedno bolj poglabljajo v razvoj kombiniranega zdravljenje, ki bo usmerjeno na več patogenih genov in poti ulceroznega kolitisa. [1]
V članku je opisan razvoj strategije sintezne biologije, ki združuje naravno obstoječi sistem malih zunajceličnih veziklov z umetnimi plazmidi za reprogramiranje jeter mišjih samcev, da se več siRNA samostojno sestavi v izločevalne male zunajcelične vezikle in omogoči dostavo siRNA in vivo prek cirkulirajočih malih zunajceličnih veziklov za kombinirano zdravljenje mišjih modelov ulceroznega kolitisa. Zlasti ponavljajoče se vbrizgavanje večnamenskega plazmida, zasnovanega za hkratno zaviranje TNF-α, B7-1 in integrina α4, hitro ublaži črevesno vnetje in ima sinergistični terapevtski učinek proti ulceroznemu kolitisu z zaviranjem provnetne kaskade v makrofagih debelega črevesa, zaviranjem kostimulacijskega signala celicam T in blokiranjem usmerjanja celic T na mesta vnetja. [1]

Kaj je ulcerozni kolitis?

Ulcerozni kolitis (UC) je vrsta kronične in ponavljajoče se vnetne črevesne bolezni (IBD), za katero sta značilna nenadzorovano črevesno vnetje in okvara epitelijske plasti debelega črevesa. V zadnjem desetletju se biološko zdravljenje s protitelesi, usmerjenimi proti prekomernemu imunskemu odzivu, intenzivno preučuje kot terapevtska možnost za bolnike z UC, zlasti v primerih, ko je bolezen odporna na konvencionalna zdravila ali pa jih ne prenaša. Glede na funkcije in mehanizme tarč, ki so vključene v imunsko disregulacijo UC, lahko sedanje biološko zdravljenje razvrstimo v več podtipov: 1) zaviranje pro-vnetnih citokinov ali povečanje učinka protivnetnih citokinov, 2) blokada usmerjanja celic T na mesta vnetja in 3) blokada aktivacije celic T. [1]
Največja težava je, da se velik del bolnikov na zdravljenje s protitelesi ne odzove ali pa postopoma razvije odpornost nanj. Hkrati ostajajo velika ovira visoki stroški zdravljenja in resni neželeni učinki, zato je potreba po razvoju novega terapevtskega pristopa za UC še vedno zelo velika. [1]
Ker je UC večfaktorski in večstopenjski proces, zgolj blokiranje enega samega vnetnega citokina ali imunološke tarče največkrat ni ustrezno in optimalno za vzdrževanje klinične remisije in doseganje dolgoročne učinkovitosti in ravno iz tega razloga je potreba po razvoju kombiniranega zdravljenja tako visoka. Zaradi visoke specifičnosti, učinkovitosti in prilagodljivosti malih interferenčnih RNA (siRNA), ki z enim odmerkom nadzorujejo več patogenih genov in poti, so terapije, ki temeljijo na interferenci RNA zelo obetavne. Načeloma lahko z oblikovanjem kombinirane ekspresijske kasete, ki nosi več enot, ki izražajo siRNA, slednje v celicah sočasno prepisujemo, kar zagotavlja preprosto in učinkovito strategijo za hkratno zaviranje več genov. Največja pomanjkljivost siRNA je, da so dovzetne za razgradnjo z RNazami in ker so anionske in hidrofilne, ne morejo učinkovito prehajati celične membrane. [1]

REZULTATI

Izgradnja in karakterizacija plazmidov, usmerjenih proti TNF-α

TNF-α je ključni pro-vnetni citokin, ki ga proizvajajo predvsem aktivirani makrofagi in limfociti T ter ima pomembno vlogo v patogenezi UC; inducira druge pro-vnetne citokine (npr. IL-1 in IL-6), pospešuje migracijo levkocitov z indukcijo izražanja adhezijskih molekul in zavira apoptozo vnetnih celic. Zato so ocenili terapevtske učinke plazmida, zasnovanega za specifično usmerjanje TNF-α v makrofagih debelega črevesa, za zdravljenje UC. Sestavili so plazmid, sestavljen iz dveh funkcionalnih modulov: promotorski modul poganja transkripcijo siRNA, kar vodi do pakiranja nasičene citoplazemske siRNA v sEV, medtem ko modul kasete za izražanje siRNA povečuje izražanje vodilne verige siRNA in zmanjšuje izražanje neželene potniške (passenger) verige. [1]

Vrednotenje samosestavljanja siRNA-kapsulirajočih sEV s siRNA TNF-α

Vzpostavili so več modelov za preučevanje samosestavljanja in izločanja siRNA, ki vsebuje siRNA TNF-α, inkapsuliranih sEV. Pri mišjih samcih BALB/c so povzročili akutni model UC, tako da so jim za 7 dni zamenjali pitno vodo z 2,5-odstotno raztopino DSS; mišim z DSS so intravensko vbrizgali CMV-scrR ali CMV-siRTNF-α vezje, nato pa so posebej preučili količine plazmidov, ki so jih sprejela mišja jetra, in količine siRNA, ki so bile zapakirane v sEV iz mišje plazme. [1,2]
Najprej so določili količino plazmidov, ki so jih prevzela jetra, in siRNA, ki so nastale v jetrih – opazili so, da je kopičenje in odstranjevanje siRNA TNF-α odvisno od časa (najvišjo vrednost je dosegla po 12 urah, po 48 urah pa se je zmanjšala na raven ozadja). Podobno je tudi neposredno sledenje siRNA TNF-α v mišjih jetrih s fluorescenčno in situ hibridizacijo (FISH) pokazalo časovno odvisno spreminjanje ravni siRNA TNF-α v jetrih- Da bi ugotovili, ali lahko povezava z Ago2 zaščiti siRNA TNF-α pred razgradnjo z RNazami v plazmi, so izmerili količine siRNA TNF-α, ki ostanejo v supernatantu po imunoprecipitaciji Ago2, in količine, pridobljene iz kroglic, imunoprecipitiranih z Ago2. Kvantitativna analiza RT-PCR je pokazala, da je bil miR-16 z imunoprecipitacijo Ago2 v primerjavi s kontrolno imunoprecipitacijo IgG v veliki meri izčrpan iz plazme in da je bilo mogoče izčrpan miR-16 učinkovito obnoviti iz imunoprecipitiranih kroglic. [1,2]
Na splošno ti rezultati kažejo, da je siRNA TNF-α prisotna v mišji plazmi v obliki (v sEV), ki jo je mogoče zlahka prenesti v druge celice, podobno kot bioaktivne miRNA v obtoku (npr. miR-155) [1,2]

Vstop siRNA TNF-α v imunske celice v vnetni sluznici

Z inkubiranjem makrofagov s plazemskimi sEV, pridobljenih iz miši DSS, katerim so vbrizgali vezje CMV-siRTNF-α, so rezultati pokazali, da lahko to vezje in vivo sproži samosestavljanje siRNA TNF-α v plazemske siRNA, ki jih lahko prejemne celice nadalje internalizirajo in tako blokirajo izražanje TNF-α. [1,3]
Ker TNF-α proizvajajo predvsem aktivirani makrofagi in limfociti T, so za količinsko opredelitev celičnega privzema siRNA TNF-α posebej izolirali makrofage, monocite (krvni monociti so nujni za stalno obnavljanje rezidenčnih makrofagov v črevesni steni) in celice CD4+ T iz lamina propria debelega črevesa, periferne krvi in vranice miši, ki so prejele CMV-siRTNF-α. V teh izoliranih imunskih celicah je bilo zaznano od časa odvisno povečanje ravni siRNA TNF-α. Tako so siRNA sEV, ki vsebujejo siRNA TNF-α, imele sposobnost dostopa do imunskih celic v vneti sluznici, krvi in vranici, kar je povzročilo učinkovito dostavo siRNA TNF-α na želena mesta. [1,3]
Pri oceni terapevtskih učinkov so ugotovili, da so imele miši DSS, zdravljene s CMV-scrR vezjem, izrazito krajšo dolžino debelega črevesa kot normalne miši, vendar je zdravljenje z visokim odmerkom vezja CMV-siRTNF-α povzročilo znatno izboljšanje dolžine debelega črevesa. Glede ravni izražanja TNF-α je bilo pri miših DSS, zdravljenih z vezjem CMV-scrR, opaženo znatno povečanje ravni mRNA in beljakovin TNF-α v debelem črevesu, medtem ko je bilo pri miših DSS, zdravljenih z vezjem CMV-siRTNF-α, opaženo od odmerka odvisno zmanjšanje ravni mRNA in beljakovin TNFα. [1,3]

Razvoj strategije na osnovi AAV9 za dolgotrajno samosestavljanje in dostavo siRNA v obliki sEV za zdravljenje UC

V nadaljevanju so se osredotočili na optimizacijo nosilcev prenosa plazmidov, da bi dosegli dolgoročni terapevtski učinek. Ker je adeno-asociirani virus (AAV) klinično varen in sposoben vzpostaviti dolgoročno izražanje transgenov, so poskušali raziskati, ali izražanje plazmida na podlagi AAV omogoča dolgoročno samoumeščanje siRNA v jetrih in povzroča stalno utišanje ciljnih genov in vivo. Celotno so vstavili v vektor AAV serotip 9 (AAV9) ocenili terapevtske učinke na modelu kroničnega UC. Ker lahko ta vektor sočasno izraža siRNA TNF-α in luciferazni reporter, lahko ocena aktivnosti luciferaze odraža kopičenje siRNA TNF-α in vivo. Rezultati so pokazali, da je izražanje plazmida s pomočjo AAV9 po enkratni uporabi zagotovilo znaten in trajen terapevtski učinek. [1]

ZAKLJUČEK

Kljub nedavnemu napredku v poznavanju patogenih mehanizmov UC ostaja precejšnja potreba po zdravljenju UC nezadovoljena. Najbolj obetavne terapevtske tarče so prekomerno aktivni imunski odzivi, biološko zdravljenje z monoklonskimi protitelesi (npr. infliksimab) pa je bilo razvito posebej za blokiranje imunoloških tarč in ublažitev imunskih odzivov.
Za dolgoročno zdravljenje kroničnega UC je večkratno vbrizgavanje plazmidov neizogibno. Da bi razvili strategijo za trajno samourejanje siRNA, zaprtih v sEV, za zdravljenje kroničnega UC, so v študiji za nosilca genetskih vezij izbrali AAV, ker je le-ta sposoben vzpostaviti dolgoročno izražanje transgenov z minimalno imunogenostjo, toksičnostjo in stranskimi učinki.
Ker lahko promotor, zaporedje siRNA in struktura pre-miRNA skupaj odločajo o poti razvrščanja siRNA v sEV pri načrtovanju plazmida, je veliko prostora za optimizacijo biološke porazdelitve siRNA, da se zagotovi prednostno razvrščanje le-te v sEV namesto njihovega zadrževanja v celicah.

Viri

[1] Zhou, X. et al. In vivo self-assembled siRNA as a modality for combination therapy of ulcerative colitis. Nature Communications. 13:5700 (2022).
[2] Knight, D. M. et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol. Immunol. 30, 1443–1453 (1993).
[3] Liu, F. et al. Current transport systems and clinical applications for small interfering RNA (siRNA) drugs. Mol. Diagn. Ther. 22, 551–569 (2018).