Inženiring bakterij Escherichia coli odzivnih na svetlobo

Izvorni članek: Levskaya, A. et al. Engineering Escherichia coli to see light, Nature, 438, 441–442 (2005). [1]

Uvod

Študenti Univerze v Teksasu so leta 2005 v sodelovanju s Kalifornijsko Univerzo v San Franciscu pod vodstvom Christopher-ja Voigt pripravili prve bakterijske fotografije v sklopu tekmovanja (Intercollegiate Genetically Engineered Machine competition) na MIT (Massachusetts Institute of Technology). S pomočjo sintezne biologije so zasnovali bakterijski sistem, ki preklaplja med različnimi stanji pod svetlobo v rdečem območju vidnega spektra. S pomočjo projekcije svetlobe na biološki film so proizvedli visoko ločljivo dvodimenzionalno živo sliko (100 megapikslov na kvadratni palec) [1].

Odziv na svetlobo

Ustvarili so svetlobni senzor, ki deluje v Escherichia coli. Enterobakterije, kot je E. coli, same po sebi niso sposobne zaznavati svetlobe, ker v njih ne najdemo fotoreceptorjev. Medtem ko rastline, alge in cianobakterije vsebujejo proteinske fotoreceptorje, znane kot fitokromi in jih uporabljajo za nadzor fotosinteze ter fototakse. Zato so uporabili fitokrom iz cianobakterije Synechocystis in sicer tako, da so ustvarili himere z bakterijsko histidin kinazo [1].

Fitokrom sestavljata dve komponenti, membransko vezan zunajcelični senzor, ki se odziva na svetlobo in znotrajcelični regulator. Zato fitokromu rečemo dvokomponentni sistem. Znotrajcelični regulatorji v večini fitokromov ne uravnavajo izražanja genov direktno, saj nimajo DNA vezavnih domen. V ta namen so pripravili fitokrom s fuzijo fotoreceptorja cianobakterij Cph1 in histidin kinaze EnvZ.

Sistem EnvZ-OmpR

EnvZ je del dobro preučenega dvokomponentnega regulatornega sistema EnvZ-OmpR, ki ob pojavu osmotskega šoka uravnava izražanje porinov OmpC in OmpF. Ob visoki osmolarnosti je EnvZ podvržen avtofosforilaciji in prenese fosforilne skupine na OmpR preko tvorbe kompleksa. Ko se število fosforiliranih proteinov OmpR poveča, pride do vezave le-tega na aktivatorska mesta promotorja ompC in spodbujeno je izražanje porina OmpC. Pri nizki osmolarnosti se poveča izražanje porina OmpF, ki ima večji premer por in tako poveča difuzijo hranil ob osmotskem šoku [1], [2].

Fikocianobilin

Dodatno, fitokromi imajo linearne tetrapirolne prostetične skupine, ki omogočajo absorpcijo vidne svetlobe in se imenujejo bilini. Bilini izhajajo iz od kisika odvisnega odpiranja obroča hema. Cianobakterije Synechocystis imajo zapis za dva encima, ki prispevata k pretvorbi hema v fikocianobilin (PCB). Ta dva encima sta hem oksigenaza (HO1) in fikocianobilin: feredoksin oksidoreduktaza (PcyA), ki katalizirata pretvorbo hema v biliverdin IXa (BV) oziroma BV v PCB. [3]

V E. coli PCB ni naravno sintetiziran, zato je bila njegova biosintezna pot uvedena preko plazmida pPL-PCB, ki je bil pridobljen od J. C. Lagarias in je bil predhodno pripravljen za biosintezo fitokroma v bakterijah. Plazmid vsebuje mesto začetka replikacije p15a in vsebuje gena ho1 in pcyA, za pretvorbo hema v PCB, pod kontrolo promotorja Para/lac. Zamenjali so le odpornost na kanamicin z odpornostjo na ampicilin [1].

Testiranje aktivnosti fitokromov

Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili E. coli RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-lacZ) 10-25 ΔenvZ :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ompC, fuziran z lacZ reporterjem.

Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin. Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena envZ ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment envZ so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta NdeI in XbaI. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko KpnI in NdeI restrikcisjkih mest [1].

Millerjev poskus

Seve RU1012, transformirane s pPL-PCB in plazmidom, ki kodira eno od himer, so gojili čez noč. Kulture so bile razredčene in izpostavljene širokemu spektru svetlobe (ena ploščica s 24 luknjicami) oziroma zaščitene pred svetlobo (druga ploščica zavita v aluminijasto folijo). Nato so izvedli Millerjev poskus, kjer gre za določanje koncentracije β-galaktozidaze. Poleg laktoze, lahko cepi tudi sintetično spojino o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) in kot produkt nastane galaktoza in o-nitrofenol, ki ima rumeno barvo. Kadar je ONPG v reakciji presežen nad encimom, je proizvodnja o-nitrofenola na enoto časa sorazmerna koncentraciji β-galaktozidaze. Tako se lahko za določitev koncentracije encima uporabi rumena barva. Eksperiment je zasnovan tako, da se promotor združi z genom lacZ. Celice so tako zbrali za analizo izražanja β-galaktozidaze pod kontrolo promotorja ompC [1], [4].

Izkazalo se je, da je najbolj aktivna himera Cph8, ki pa ima eno aminokislino manj kot himera, ki se je izkazala za najbolj aktivno po poravnavi. Ta vsebuje prvih 517 aminokislin Cph1 in zadnjih 229 aminokislin EnvZ. Himera je bila ligirana v pPRO-HK in pri tem so tvorili pCPH8. V domeni Cph1 ni bilo nobenih substitucij aminokislin, medtem ko obstaja mutacija I v V na mestu 136 domene EnvZ. Millerjev poskus je pokazal, da je Cph8 v prisotnosti PCB v temi aktivna in na svetlobi neaktivna. V odsotnosti Cph8 ni svetlobno odvisne aktivnosti in obstaja konstitutivna aktivnost, kadar je izražena samo domena histidin kinaze EnvZ, ali kadar ni inducirana presnovna pot PCB [1].

Snemanje bakterijskih fotografij

Vse bakterijske slike so bile posnete z uporabo E. coli, seva CP919, ki je izpeljan iz RU1012 in nosi dodaten transpozon. Transpozon povzroči inaktivacijo genov rbsK in rbsB, ki zapisujeta za ribokinazo ter protein, ki veže ribozo. Sev je bil transformiran s pPCB in pCPH8, kar je ustvarilo svetlobno občutljiv sev za poskuse bakterijske fotografije. Bakterije so gojili na agarnih ploščah. Ob aktivaciji s svetlobo je prišlo do izražanja LacZ, ki pa katalizira tvorbo stabilne črne oborine iz S-gal (3,4-cikloheksenoskuletin-β-D-galaktopiranozid). Rdeča svetloba poganja senzor v stanje, v katerem je avtofosforilacija EnvZ inhibirana, kar zavre izražanje genov in tako ne pride do tvorbe črne spojine. Na območju svetlobe se zato pojavijo svetli deli, na temnih območjih pa temni deli slike. Z naraščajočo intenzivnostjo svetlobe so pokazali tudi stopenjski odziv sistema. Aktivnost pri najbolj intenzivni svetlobi je bila minimalna [1].

Kamera

Bakterijska kamera, ki se uporablja za snemanje slik je sestavljena iz vira svetlobe, ki je 100W svetilka in slikovnega projektorja z objektivom za ostrenje slike. Slednji je nameščen 75 mm nad 632 nm ozkim optičnim pasovnim filtrom. Pod filtrom je 35-milimetrski diapozitiv, na katerega je posneta fotografija, ki je nameščena na električni pogon, ki se uporablja za nastavitev ostrine. Slika je projicirana 38 cm pod objektiv v inkubator in na veliko ploščo, ki vsebuje biofilm [1].

Napredki v bakterijski fotografiji

Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje E. coli zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov. Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na Synechocystis CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] . Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390

Zaključek

Njihovo ustvarjanje novega genetskega vezja leta 2005 s funkcijo obdelave slik z izražanjem črnega barvila prikazuje uporabnost ter dostopnost orodij in metod, poleg tega pa napredek v nastajajočem polju sintezne biologije. Prostorski in časovni nadzor izražanja genov v posameznih celicah in populacijah bi se lahko uporabil za preučevanje signalnih poti, večceličnih signalnih omrežij, izdelavi kompozitov bioloških materialov ter v bakterijski mikrolitografiji. Razmišljali so v smeri, da bi namesto izdelave črnega pigmenta bakterije sintetizirale proteine, kot je pajkova mreža. Do leta 2017 je opazen viden napredek v bakterijski fotografiji in uporabi svetlobnih senzorjev v druge namene. Posamezni senzorji svetlobe so bili uporabljeni za induciranje lize, urejanje genoma in tudi biomedicinske aplikacije. Popolno izkoriščanje celotnega spektra svetlobnih senzorjev hkrati v posameznih celicah zagotavlja številne gumbe, s katerimi lahko nadziramo celice hitro in, prostorsko in od daleč.

Viri in literatura

[1] Levskaya, A. et al. Engineering Escherichia coli to see light, Nature, 438, 441–442 (2005).

[2] Sheng Jian Cai and Masayori Inouye, EnvZ-OmpR Interaction and Osmoregulation in Escherichia coli, The Journal of Biological Chemistry, 277, 24155-24161 (2002).

[3] G. A. Gambetta and J. C. Lagarias, Genetic engineering of phytochrome biosynthesis in bacteria, Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 10566–10571 (2001).

[4] Smale ST., Beta-galactosidase assay, Cold Spring Harb Protoc. (2010).

[5] J. Fernandez-Rodriguez, F. Moser, M. Song and C. A. Voigt, Engineering RGB color vision into Escherichia coli, Nature Chemical Biology, 13, 706–708 (2017)