Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola

Engineering of a microbial coculture of Escherichia coli strains for the biosynthesis of resveratrol

Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic E.coli.

Biosinteza resveratrola

Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina (L-Tyr) ali L-fenilalanina (L-Phe) v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-Tyr v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-Phe, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).

Razdelitev biosintezne poti resveratrola med dve populaciji celic E.coli

Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu E.coli W3110. Ker izbrane celice nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene (iz rastlin ali drugih mikroorganizmov) za manjkajoče encime.

Celice za proizvodnjo p-CA vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke R.glutinis) in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA. Pri izražanju teh dveh genov nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti, ki se stopenjsko pretvori v prefenat. Le-ta pa se pretvarja v L-Phe in L-Tyr. Zaželjeno je, da celice proizvajajo čim več L-Tyr, zato so celicam inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije (pretvarjajo p-CA v resveratrol). Te imajo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili gen za 4CL iz mikroorganizma S. coelicolor, tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz A.hypogaea in V.vinifera).

Rezultati

Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z genom za STS iz V.vinifera, ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz V.vinifera višja v primerjavi z STS iz A.hypogaea. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo). Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.

Kokultura omenjenih populaciji celic v razmerju 1:1 proizvede v enostavnem gojišču z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v podobnem gojišču in primerljivem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.

Zaključek

Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi s številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z nadaljno optimizacijo kokulture in pogojev še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.

Viri

1. J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of Escherichia coli strains fort he biosynthesis of resveratrol.” Microbial cell factories 2016, 15, 1-11.
2. A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered Escherichia coli.” Microbial cell factories 2015, 14, 1-12.
3. J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans.” Oxidative medicine and cellular longevity 2015, 2015, 1-13.