In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/

UVOD

Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.

ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov

TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnih prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata.

METODE

TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.

DIZAJN TALEN-ov

Pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina vmesnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj vmesnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.

UPORABA ZEBRAFISH-A

Zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo.

RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U

S pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.

RAZISKAVE NA GoldyTALEN OGRODJU

Za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu.

ZAKLJUČEK

Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.

VIRI

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017) https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017) http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)