Izvencelična lipaza iz Amycolatopsis Mediterannei je kutinaza z možnostjo razgradnje plastike.

Uvod

Članek se osredotoča na izvencelično lipazo iz Amycolatopsis Mediterannei, ki je bila pred kratkih klonirana in pregledana v laboratoriju. S primerjalnim modeliranjem je bila določena 3D struktura. Odkrili so, da lipaza ne vsebuje domene podobne pokrovu, ki zakrije aktivno mesto in da je strukturno zelo podobna encimom, ki razgrajujejo plastiko. Tako je bilo hitro jasno, da je encim potencialno uporaben za bioremediacijo plastike. Preko BlastP iskanja v PDB bazi podatkov, jim je uspelo sestaviti filogenetsko drevo proteinov, ki so evolucijsko najbližje AML. Odkrili so, da je AML v kar 75% podobna Streptomyces exfoliatus in zato so ravno ta protein uporabili kot model. Poravnava sekvenc s modelom, katalitično triado in AML so bili identificirani ostanki, ki izoblikujejo oksianion – ti ostanki so Ser178, Asp224, His256, Phe110 in Met179. Ser178, Asp224 IN His256 je triada, ki je ključna za hidrolizo acetilne skupine. Amidno ogrodje Phe110 in Met179 pomagajo stabilizirati encim-substrat intermediat preko vodikove vezi s karbonilnim kisikom substrata. Katalitična triada in ostanki oksianiona izoblikujejo del žepka, ki veže substrat. Preko poravnave so odkrili tudi, da encim ne vsebuje domene podobne pokrovu. Pomanjkanje domene podobne pokrovu pa je bilo zaznavo pri velikem številu kutinaz, ki razgrajujejo plastiko. V AML modelu lahko vidimo tipično α/β hidrolazno strukturo. Ima centralno β ploskev obdano z α vijačnicami. Najdena je bila tudi disulfidna vez, pod β ploskvijo pa se nahajajo ostanki, ki sestavljajo žepek za vezavo substrata. Eksperimentalno so določili preferenco AML za vezavo srednje dolgih maščobnih kislin, kar se tudi ujema s preferenco kutinaz. To nakazuje na dejstvo, da so AML bližje kutinaznim vrst lipaz, kakor pa esteraznih oz. pravih lipaz.

Sposobnost razgradnje plastike

Odkrili so, da je AML homologna različnih kutinazam, ki razgrajujejo plastiko. AML lahko razgrajuje več vrst plastik: Alifatski plastični poliestri: PLAji so sestavljeni iz monomerov mlečne kisline, je zelo široko uporabljena plastika in najhitreje rastoči trg za bioplastiko. Znano je, da je močno odporna proti razgradnji v naravi. AML ni uspešna pri razgradnji PLA plastike, a lahko razgrajuje polikaprolaktone. Polikaprolaktoni so tudi vrsta bioplastike, ki se jo veliko uporablja v enkapsulaciji zdravil. AML pa je bil najuspešnejši pri razgradnji poli(1,4-butilen sukcinatu), ki je podaljšan s 1,6-diisocianatoheksanom oz. na krajše PBSc-D. Strukturna in sekvenčna analiza za predikcijo razgradnje PLA Iz baze podatkov so raziskovalci uporabili sekvenco kutinaze Est119 iz Thermobifida alba, ki je zelo podobna AML. Zanimalo jih je, zakaj AML ni sposobna razgradnje PLA, tako so AML primerjali s kutinazo Est119, ki pa je sposobna razgradnje PLA. Sekvenci so poravnali in opazovali razlike. Našli so prekrivanje ključnih ostankov v obeh encimih. Opazovali so še kristalno strukturo Est119 z vezanim etil acetatom in mlečno kislino, ki sta analoga PLA. S PyMOL sta bili strukturi poravnani, da bi preverili katalitično in vezavno mesto za substrat za razgradnjo PLA. Med obema aktivnima mestoma pa so našli tudi razlike. Tako je Tyr99 v Est119 poravnan s Phe110 iz AML in Ile217 s Val226. ti dve razliki igrata pomembno vlogo pri dejstvu, da AML ni sposoben razgraditi PLA.

Razgradnja aromatskih plastik

Da bi preverili, ali AML lahko razgradi PET so opravili HPLC analizo. Preverjali so vsebnost TPA in BHET, ki se sprostita po razgradnji PET. Determinirali so, da AML ne more razgrajevati PET, a odkrili so, da kutinaze, ki so zmožne razgrajevati PET imajo veliko strukturnih podobnosti s AML. AML sekvenco so poravnali z dvema sekvencama encimov, ki sta sposobna razgrajevati PET. Sledila je bioinformatska analize, kjer so primerjali ostanke na specifičnih mestih in odkrili, da so si vse sekvence med sabo podobne. Tudi ostanki v aktivnem mestu so si med seboj zelo podobni, najdene so bile le manjše razlike. AML so primerjali tudi s TfCut2, ki je kutinaza iz T. fusca. Oba encima si delita 77% podobnost. TfCut2 je encim, ki je sposoben razgrajevati PET. Po poravnavi sekvenc so odkrili visoko podobnost med katalitičnimi ostanki. Pri obeh encimih so zelo zaznali enako katalitično triado. Najpomembnejši ostanek je fenilalanin na mestu 110 v AML, ki je pri encimih PETaze spremenjen v tirozin, slednji naj bi pripomogel k stabilizaciji intermediata. Ta fenilalanin na mestu 110 je bil opažen tudi pri poravnavi za razgradnjo PLA, zato so raziskovalci sklepali, da ta ostanek igra pomembno vlogo tako pri razgradnji in vezavi PET kot PLA.

Viri

1. An extracellular lipase from Amycolatopsis mediterannei is a cutinase with plastic degrading activity (T. Yeqi; Computational and Structural Biotechnology Journal 19; 2021,