Konverzija lignoceluloze s pomočjo izkoriščanja mikrobne tolerance in inženiringa sladkorjev

Nieves, L. M. et al. Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion. Front Bioeng Biotechnol, 3:17 (2015).

Uvod

Kot primarni vir goriv za transport ter za proizvodnjo mnogih kemičnih izdelkov se danes še vedno uporablja nafta, ki pa ima mnogo negativnih učinkov na okolje. Jasno je, da moramo najti trajnostno rešitev za oskrbo sveta z energijo s pomočjo obnovljivih virov ter tako doseči neodvisnost od nafte. V ta namen se poslužujemo sintezne biologije, definirane kot konstrukcijo novih bioloških sestavnih delov, ki jo vedno pogosteje srečujemo v povezavi z biogorivi (Ferry in sod., 2012; Keasling, 2008). Najpomembnejša vrsta biogoriva je lignoceluloza, ki jo sestavljajo različni polisaharidi, fenolni polimeri in proteini, ki so prisotni v celični steni olesenelih rastlin (Saha, 2003). Sladkorji v lignocelulozi so zaklenjeni v zelo stabilne polimerne strukture, kot so celuloza, hemiceluloza ter lignin, ki so bile naravno ustvarjene ravno zato, da se upirajo dekonstrukciji (Alvira in sod., 2010). Prav zato je potrebno lignocelulozo predhodno kemično obdelati, to povzroči večji dostop celulazam, ki depolimerizirajo polisaharide, sladkorji pa se sprostijo v brozgo, kjer se ob pomoči ustreznega biokatalizatorja dalje pretvorijo v gorivo in kemikalije (Alvira in sod., 2010). Ker pa zaenkrat še ni ustreznih celulaznih encimov, ki bi bili upoštevajoč ceno primerni za komercializacijo, to predstavlja prvi izziv, s katerim se srečujejo sintezni biologi (Nieves in sod., 2015). Drug izziv za znanstvenike je, da se med omenjeno kemično obdelavo tvorijo stranski produkti, kot je naprimer furfural, ki ustavijo celično rast in fermentacijo (Mills in sod., 2009). Rešitev za to težavo je sicer znana, in sicer zvišanje pH na 10 s pomočjo Ca(OH)2, vendar to ni ekonomično, saj se povečata tako kompleksnost procesa kot tudi njegovi stroški (Martinez in sod., 2000). Poleg tega pa je eden izmed glavnih ogljikovih hidratov v lignocelulozi D-ksiloza, aldoza, sestavljena iz 5 ogljikovih atomov, ki pa jo večina mikrobov zelo težko metabolizira (Nieves in sod., 2015). Kljub temu, da imajo nekateri mikrobi, kot je E. coli, nativno metabolno pot za ksilozo, pa le-ta ni učinkovita, zato optimizacija teh poti predstavlja velik izziv za sintezne biologe (Saha, 2003).

Genetske izboljšave izkoriščanja in transporta monosaharidov, dobljenih iz lignoceluloze

Rezultat hidrolize hemiceluloze in celuloze s pomočjo kemičnega predprocesa je mešanica pentoz in heksoz, mikroorganizmi pa selektivno izkoriščajo povečini D-glukozo (Nieves in sod., 2015). Lignocelulozni materiali v večji meri vsebujejo D-ksilozo, metabolizem katere je v večini mikroorganizmov zelo počasen ali ga celo ni, ker ga zatre glukoza preko procesa katabolitske represije (Girio in sod., 2010). Sintezni biologi iščejo načine za izboljšanje ksilozne fermentacije ter poskušajo vplivati na mikroorganizme tako, da bi simultano lahko uporabljali tako glukozo kot tudi ksilozo.

Metabolizem ksiloze v glivah

Razgradnja ksiloze je pri glivah in bakterijah različna. Pri glivah poteka tako imenovana oksidoreduktazna pot, in sicer je to običajna anaerobna fermentacija ksiloze, ki poteka v dveh korakih, in sicer se D-ksiloza najprej pretvori v intermediat ksilitol s pomočjo ksilozne reduktaze, ki za kofaktor potrebuje še NADPH, encim ksilitol dehidrogenaza pa ob pomoči kofaktorja NAD povzroči pretvorbo v D-ksilulozo. Tretji encim, ksilulokinaza, poskrbi za fosforilacijo ksiluloze v D-ksilulozo-5-fosfat, ki vstopi v pentozno fosfatno metabolno pot. V kromosomu Saccharomyces cerevisiae sicer so geni za vse omenjene encime, a je njihovo izražanje premajhno, da bi bila celična rast na ksilozi kot glavnem viru ogljika možna (Toivari in sod., 2004). Kljub temu pa Ho in sodelavci (1998) v članku opisujejo uspešen primer inženiringa Saccharomyces sp., in sicer so uporabili sev 1400(pLNH32). V plazmid pLNH32 so pod kontrolo močnega nativnega glikolitičnega promotorja vstavili gena za ksilozno reduktazo in ksilitol dehidrogenazo iz P. stipitis, ter ksilulokinazne gene iz S. cerevisiae. Prišlo je do aerobne pretvorbe ksiloze v etanol s precej visokim izkoristkom (pribl. 0,45 g etanola na 1 g ksiloze). V prihodnjih letih so se tega lotile še druge raziskovalne skupine, in tako je Matsushika s sodelavci (2009) z uporabo industrijskih sevov TMB 3400 in 424A (LNF-ST) metabolizem ksiloze dodatno izboljšal.

Metabolizem ksiloze v bakterijah

Pri bakterijah je nativna pot za razgradnjo ksiloze imenovana ksilozna izomerazna pot. D-ksiloza se pri tem procesu neposredno pretvori v D-ksilulozo s pomočjo ksilozne izomeraze, pri tem pa za razliko od oksidoreduktazne poti tudi ne potrebujemo reducirajočega kofaktorja (Nieves in sod., 2015). Izomerazna reakcija je termodinamično pomaknjena v levo, zato zahteva gonilno silo, ki poskrbi, da je reakcija usmerjena v tvorbo produkta, torej D-ksiluloze. Sintezni biologi so poskušali s pomočjo povečanega izražanja genov za bakterijske in tudi glivne izomeraze povečati učinkovitost omenjene metabolne poti, in sicer v bakterijah, skonstruirali pa so jo tudi v S. cerevisiae, vendar organizmi na ksilozi niso rasli, ali pa so rasli zelo počasi (Liu in sod., 1988; Walfridsson in sod., 1996; Kuyper in sod., 2003; Lee in sod., 2012). Zhang in sodelavci (1995) so s povečanim izražanjem genov za ksilozno izomerazo in ksilulokinazo ter genov za transaldolaze in transketolaze, ki so glavni encimi v pentozni fosfatni poti, dobili rekombinantno bakterijo Zymomonas mobilis z delujočim ksiloznim metabolizmom, in sicer je njihov sev CP4 (pZB5) sposoben 1 g ksiloze pretvoriti v 0,44 g etanola. Njihovi rezultati kažejo na to, da je visok tok nadaljnjih reakcij, npr. pentozne fosfatne poti, ključen za funckionalno presnovo ksiloze.

Transport ksiloze

Poleg uspešne pretvorbe lignoceluloze pa je pomemben tudi transport mešanice sladkorjev v celice, in sicer je transport ksiloze manj učinkovit od transporta ostalih sladkorjev, poleg tega pa pogostokrat tudi inhibiran s strani D-glukoze (Luo in sod., 2014). Z namenom izboljšanja ksiloznih transporterjev so znanstveniki s pomočjo mutageneze izbrali kvasne heksozne transporterje, ki so imeli visoko afiniteto na ksilozo, ter identificirali regije in motive omenjenih transporterjev, vendar je na tem področju potrebnega še veliko dela (Farwick in sod., 2014; Young in sod., 2014).

Inženiring biokatalizatorjev, ki so odporni na lignocelulozne inhibitorje

Fermentacijo sladkorjev oz. hidrolizatov, ki nastanejo po kemični obdelavi polisaharidov, ovirajo stranski produkti, ki se tvorijo ob tem predtretmaju: furan aldehidi (5-hidroksimetilfurfural oz. 5-HMF, furfural), organske kisline in fenolne spojine (Saha, 2003). 5-HMF nastane ob dehidraciji heksoz, furfural pa se tvori ob dehidraciji pentoz, in sicer je slednji bolj toksičen in deluje toksično na industrijske katalizatorje (E. coli, S. cerevisiae), hkrati pa potencira toksičnost ostalih spojin (Zaldivar in sod., 1999). Sintezni biologi se zato trudijo identificirati in optimizirati biološke komponente, da bi povečali odpornost na furan aldehide, saj je njihova toksičnost precej kompleksna in vključuje mnogo faktorjev (Mills in sod., 2009). Celična rast se ob prisotnosti furan aldehidov popolnoma zaustavi, rast pa se nadaljuje šele ob popolni redukciji furfurala, kar je bilo opaženo tako pri E. coli kot tudi pri S. cerevisiae (Taherzadeh in sod., 2000; Wang in sod., 2012). V naravi obstajata dve metabolni poti, preko katerih se furan aldehidi metabolizirajo oz. reducirajo, in sicer je en način omejen samo na aerobne pogoje, kar pa pri fermentaciji, ki je anaeroben proces, ne pride v poštev. Drug način se izvaja pod anaerobnimi pogoji, in sicer E. coli in S. cerevisiae uporabita nativne oksidoreduktaze, ki reducirajo furan aldehide v furan alkohole, ki so mnogo manj toksični, poleg tega pa se lahko izločijo iz celice in ostanejo v fermentacijski brozgi, brez da bi se dalje razgradili (Zaldivar in sod., 1999; Wang in sod., 2012). Celice začnejo tako rasti šele takrat, ko je koncentracija furfurala ali 5-HMF manjša od 5 mM (Wang in sod., 2012). Različne raziskovalne skupine so povečale izražanje nativnih oksidoreduktaznih genov v S. cerevisiae, kot so ADH1, ADH6 in ADH7, ki zapisujejo za encime, ki so zmožni reducirati furan aldehide in tako skrajšajo časovni interval, med katerim celice ne rastejo (Laadan in sod., 2008; Petersson in sod. 2006; Liu in sod., 2008). Ugotovili so, da prisotnost furfurala aktivira izražanje gena yqhD, ki zapisuje za oksidoreduktazo, ki je zmožna reducirati furfural, vendar za to uporabi NADPH kot reducirajoči faktor, le-tega pa je pod anaerobnimi pogoji zelo malo in rast E. coli se ustavi (Miller in sod., 2009). Prav zato delecija yqhD povroči odpornost E. coli na furan aldehide. Poleg vseh omenjenih mehanizmov pa furfural v S. cerevisiae povzroči tudi oksidativni stres, in sicer inducira akumulacijo reaktivnih kisikovih spojin, naredi škodo v mitohondrijih, vakuolnih membranah in citoskeletu (Allen in sod., 2010). Po drugi strani pa furan aldehidi oksidativnega stresa v E. coli ne vzbudijo, za to pa je odgovorna s transkriptomsko analizo odkrita oksidoreduktaza UcpA, katere funkcija še ni popolnoma definirana (Wang in sod., 2012). Tu pa se kompleksnost toksičnosti furan aldehidov ne konča; dodatne raziskave so vodile še v odkritje koristnih plazmidov, poliaminskih transporterjev in kopice ostalih genov, katerih povečano izražanje povzroči bolj ali manj večjo odpornost na omenjene toksine (Zheng in sod., 2012; Geddes in sod., 2014; Glebes in sod., 2014).

Zaključek

Učinkovit ksilozni metabolizem in toleranca na furan aldehide sta zelo zaželjena za mikrobne katalizatorje, ki se jih uporablja pri pretvorbi lignoceluloze. Danes se s širjenjem znanja o ksiloznem metabolizmu in transportu sintezni biologi ukvarjajo predvsem z integriranjem optimalnih kombinacij različnih bioloških delov v industrijsko primerne seve, pomagajo pa si z novimi genomskimi orodji. V zadnjem času se znanstveniki ukvarjajo predvsem z epistatičnimi interakcijami, ki jih je nemogoče predvideti, hkrati pa imajo velik učinek na končen izdelek. Kljub vedno novim izboljšavam na področju tehnologije, pa je eksperimentalno delo na tem področju zelo zahtevno in tudi časovno dolgotrajno, vendar je končni cilj še vedno jasen: ustvariti sev z visoko učinkovitostjo hkratnega izkoriščanja večih sladkorjev in z odpornostjo na stranske toksične produkte za proizvodnjo goriv in kemikalij iz lignocelulozne biomase.