Modularni biološki sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

Uvod

Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga Chlamydomonas reinhardtii je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote Chlamydomonas primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije »Golden Gate«, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom Chlamydomonas.

Standard in vsebina kompleta MoClo

Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za Chlamydomonas, a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti BpiI in BsaI odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne.