Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma

Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma

Izhodiščni članek:Modular, synthetic chromosomes as new tools for large scale engineering of metabolism

Uvod

Za konstruiranje efektivnih in še bolj sposobnih celic se je včasih treba poslužiti intenzivnega genskega inženiringa. S tem se lahko celicam v genski zapis doda zapis za neko funkcijo oziroma se pripiše opravljanje dodatnih funkcij, lahko pa se tudi preoblikuje že obstoječe naravne metabolične poti. Ker so želeli to področje še dodatno raziskati, so naredili študijo o uporabi sintetičnih neokromosomov, z njo pa so dokazali, da je izvedljivo reprogramirati genom s pomočjo modularnih, sintetičnih, specializiranih de-novo sestavljenih kromosomov. Študijo so izvedli s kvasovkami (Saccharomyces cerevisiae). Izdelati so želeli t.i. NeoChrs, s katerimi bi raziskali koncept zamenjave oziroma optimizacije metabolične poti, s tem da bi določene gene reducirali ali pa jih združili. S tem bi se zmanjšalo število potrebnih genov, ki bi jih lahko relokalizirali na en sam kromosomski lokus, povzročili pa bi remodeliranje celotne presnovne poti.[1]

S pomočjo teh sintetiziranih kromosomov so sestavili mikrobno celično tovarno za de-novo proizvodnjo antocianinov. [1] Tako imenovane mikrobne celične tovarne so združba bakterij in gliv, ki lahko proizvajajo različne naravne produkte, kakor je recimo biodiesel, razna naravna zdravila, karoten in še drugi. Mikroorganizmi so namreč pod določenimi pogoji zelo efektivni, kar se tiče bioprocesiranja raznih snovi. Napredek v genetskih tehnikah in v optimizaciji procesov dandanes vodi k izboljšanju biosintez naravnih proizvodov, kar je koristno pri izboljšanju sestavin s številnimi aplikacijami v živilih, kozmetiki ter v medicini za zdravila. [1] [2]

Mikrobne celične tovarne imajo sicer velik potencial za trajnostno proizvodnjo, ampak so iz ekonomskega vidika bolj potratne kakor zahtevni kemijski procesi. Da bi se izboljšalo učinkovitost glede na stroške, bi bilo potrebno spremeniti proces, s tem pa bi se doseglo boljše izkoristke. To je mogoče doseči samo z genskim inženiringom mikrobnih gostiteljskih celic, kjer je poudarek na transplantaciji novih funkcij in urejanju metabolnih mrež, kamor se te nove funkcije vključi. Sam postopek predstavlja kar velik izziv, sploh pri delu z nekaterimi evkariontskimi celičnimi tovarnami, kjer je nekodirajočega genetskega materiala kar precej.[1]

Zamenjave presnovnih poti bi lahko bile v biotehnoloških reakcijah precejšnje, saj bi s tem omogočale močno reprogramiranje metabolizma celičnih tovarn. Pa vendar bi to pomenilo, da se integrira (vključi) več sto genov na obstoječih kromosomih, kar bi lahko vodilo do genetske nestabilnosti. Ta problem bi se dalo rešiti z uporabo de-novo sintetičnih kromosomov (NeoChrs), ki bi služili kot “ekspresijska platfoma” za remodeliranje genov. NeoChrs posnemajo naravne kromosome glede mitotske sposobnosti in glede genetskega zapisa, možno je prilagoditi tudi število kopij in neškodljivost za gostitelja, vse to pa se ureja s pomočjo CRISPR/Cas9 metode za urejanje DNA. V študiji so natančneje raziskovali proces proizvodnje antocianina pelargonidin-3-O-glukozida iz glukoze (P3G), ki je industrijsko in živilsko barvilo. Tega poskusa so se lotili kljub temu, da je bilo dokazano, da je proizvodnja antocianinov v S. cerevisiae, v doslej uporabljenih mikrobnih platformah, neučinkovita. P3G je zelo ustrezna paradigma (vzorec delovanja) za prikaz potenciala neokromosomov v metaboličnem inženiringu. Izdelani so bili neokromosomi v linearni in krožni obliki, ki so vsebovali avtohtone kvasovke, bakterijske in rastlinske gene, potrebne za sintezo P3G. [1]

Rezultati

Izdelali so kromosome, ki bi omogočili ekspresijo genov iz kvasovk, bakterij in rastlin, potrebnih za produkcijo P3G. Prekurzorja za P3G sintezo v kvasovkah sta L-tirozin in L-fenilalanin. Za de-novo sintezo P3G iz glukoze je pomembna pentoznofosfatna pot (PPP), sinteza citosolnega acetil-CoA in malonil-CoA ter sinteza (aromatskih) aminokislin. Geni, ki kodirajo za encime v teh omenjenih poteh so razpršeni po 16 različnih kromosomih kvasovk. [1]

Uporabljen sev, SwYG, ima samo en lokus, minimizirano pot glikolize in fermentacije (13 genov, vključenih v pretvorbo glukoze v etanol). Ta sev je bil potem preoblikovan z redukcijo PPP poti (odstranjeni 4 paralogi), cilj je bil da bi se spremenilo lokacijo genov, ki zapisujejo za glikolizo, fermentacijo etanola in PPP iz nativnih kromosomov na NeoChrs. S. cerevisiae ima precej strogo regulirano biosintezo aminokislin, zato so za večjo sintezo Tyr in Phe za sintezo P3G potrebne celotne poti za sintezo aminokislin iz E. Coli (10 genov). Pri proizvodnji flavonoidov so neželeni stranski produkti fuzelni alkoholi in kisline, zato je treba odstraniti 2-oksokislinske dekarboksilaze, ki so odgovorne za proizvodnjo teh stranskih produktov.[1]

Če povzamemo, so sintetizirali NeoChrs za sintezo P3G, ti sintetični kromosomi pa so bili mišljeni kot ekspresijska platforma za glikolitične, fermentativne in pentoznofosfatne poti (20 genov), tudi za biosintezo aminokislin (10 genov) in vključenih je bilo 11 genov iz rastlin, ki imajo vlogo pri sintezi P3G iz Tyr in Phe. Homologija sintetičnih kromosomov NeoChr je bila omejena na minimum, da bi se preprečilo neželene rekombinacije. Pri sintezi NeoChr so morali paziti še na prostorsko organiziranost. Geni za glikolizo, PPP, fermentacijo in sintezo aromatskih aminokislin so bili združeni. Transkripcijske enote so bile od teh ločene z 5kb dolgimi nekodirajočimi fragmenti DNA iz E. Coli, da ni prišlo do utišanja genov.[1]

NeoChr so sestavili v dveh korakih. V prvem koraku so sintetizirali 100kb velike krožne kromosome in linearne kromosome, v drugem koraku pa so bili integrirani geni za sintezo antacianinov iz rastlin. Vzeli so 11 antocianinskih genov iz Arabidopsis thaliana ter Rhodo bacter capsulaus in jih integrirali v neokromosome. [1]

Na koncu so naredili več sevov (označeni z IFMXXX; XXX so bile številke), katerih učinkovitost so preverjali v prezračenih bioreaktorjih z nadzorovanim pH. Pri končnih analizah so primerjali seve IMF41, IMF42 in IMF48. Pri sevu IMF41 so sintetizirali krožni kromosom, IMF42 je bil linearni, pri sevu IMF48 pa so že uredili DNA s pomočjo CRISPR/Cas9. Ta sev je imel 8 dodatnih kopij gena coAtCHS3 in okvarjen coAtANS. Struktura NeoChrs v IMF41 in IMF42 ni vplivala niti na fiziologijo kvasovk, niti na tvorbo flavonoidov, oba imata samo eno kopijo coAtCHS3 in okrnjen coAtANS. IMF48 je bil boljši, proizvedel je 14-krat več flovonoidov, precej večja je bila tudi proizvodnja metabolitov za AtANS (truncated anthocyanidin synthase AtAns). IFM48 je proizvedel zunajcelični P3G, medtem ko ga IFM41 in IFM42 nista. Pri IFM48 je bil delež flavonoidov v aromatskih spojinah 15%, pri IFM41 in IFM42 pa samo 2%. [1]

Zaključek

Predstavljena študija prikazuje, da je potencial S. cerevisiae za hitrejše in intenzivnejše remodeliranje genoma, preko sintetiziranih kromosomov, dober. Sinteza specializiranih kromosomov je dokaj enostavna in hitra. NeoChr kromosomi dobro posnemajo naravne kromosome (oziroma so dovolj podobni in ustrezni), kar se tiče replikacije in segregacije. Njihovo vzdrževanje je enostavno, prav tako pa niso toksični za gostiteljski organizem, zato bi bili uporabni v genskem inženiringu.[1]

Te modifikacije so omogočile sintezo antocianinov iz glukoze, kar je tudi prvič, da se je P3G sintetiziral zunajcelično (prvi zapis o produkciji zunajceličnega P3G) v kvasovkah. NeoChrs niso samo služili konstrukciji seva in remodeliranju genoma, ampak so tudi preprečili interference z naravnimi/nativnimi kromosomi. [1]

V svoji trenutni zasnovi so neokromosomi zelo uporabni (neškodljivi za gostitelja, nosijo veliko informacij na krajšem zaporedju), se pa še vedno poraja vprašanje kakšen bi bil optimalen načrt za sintezo neokromosomov. In vivo lahko pride do neželene homologne rekombinacije, čeprav so bili NeoChr pri testiranju stabilni. V tej študiji so zato tudi testirali, da bi naredili DNA dele kar se da “homology-free” (težko, saj je malo, omejeno število močnih, konstitutivnih promotorjev), zato so implementirali promotorje sorodnih vrst S. cerevisiae. Homologija je bila kljub temu še vedno približno 75%, tako da bi v prihodnosti lahko poskusili z uporabo promotorjev, ki niso sorodni. [1]

Sintetizirani neokromosomi bi bili torej uporabni za optimizacijo procesov v mikrobnih celičnih tovarnah, saj bi bili specializirani in bi lahko targetirali točno določene metabolične poti. [1]

Literatura

[1] E. D. Postma, E. J. Hassing, V. Mangkusaputra, J. Geelhoed, P. de la Torre, M. van den Broek, C. Mooiman, M. Pabst, J. M. Daran, P. Daran-Lapujade: Modular, Synthetic Chromosomes as New Tools for Large Scale Engineering of Metabolism. Metab. Eng. 2022, 72, 1–13.

[2] M. H. Hussain, M. Z. Mohsin, W. Q. Zaman, J. Yu, X. Zhao, Y. Wei, Y. Zhuang, A. Mohsin, M. Guo: Multiscale Engineering of Microbial Cell Factories: A Step Forward towards Sustainable Natural Products Industry. Synth. Syst. Biotechnol. 2022, 7, 586–601.