Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu
UVOD
Rak materničnega vratu je posledica okužbe s humanim papiloma virusom (HPV). Vsako leto je na svetu na novo odkritih 470.000 primerov raka na materničnem vratu, od katerih se približno polovica konča s smrtnim izidom. Od vseh odkritih onkogenih HPV, sta najbolj pogosta serotipa 16 (HPV16) in 18 (HPV18). V današnjem času se uporablja preventivno HPV cepivo, ki zaščiti paciente pred prvo okužbo s HPV. Težava nastopi, ker obstoječe cepivo ne pomaga pri okužbah, ki že obstajajo. Zaradi tega je nujno potrebno terapevtsko cepivo, s katerim bi lahko okužbe pozdravili. Terapevtska cepiva, ki so jih razvili do zdaj, so delovala na HPV onkogene, E6 in E7. Problem teh cepiv je bil v tem, da niso mogla v celoti izkoreniniti lezij. Največ pozornosti v zadnjem času posvečajo onkogenu E5. E5 transformira mišje fibroblaste v tkivni kulturi in je vključen v celično proliferacijo. Velja torej, da HPV izraža tri ključne onkoproteine, E5, E6 in E7, ki lahko transformirajo celice in vitro in so povezani s karcinogenezo raka na materničnem vratu in vivo. Peptidno cepivo je najbolj uporabno antigen specifično cepivo. Je varno in enostavno za proizvesti, vendar je njegova imunogenost šibka in hitro metabolizira. V zadnjem času preizkušanju dolgi-peptid cepivo (long-peptide, LP), ki ga je enostavno pripraviti, je varno za uporabo in ima več epitopov, kar da cepivu močno imunogenost. V tej študiji so poskušati sestaviti dve vrsti LP cepiva, optimizirati imunizacijsko tehniko in testirati učinkovitost cepiv za induciranje dolgotrajnega imunskega spominskega odgovora v miših.
POSTOPEK DELA IN REZULATATI
Pripravili so dve LP cepivi z več epitopi, ki so jih dobili iz HPV16 onkogenov E5, E6 in E7. Učinkovitost cepiv so testirali na celičnemu modelu in vitro in na induciranih tumorskih celicah na mišjem modelu in vivo. Najprej so sintetizirali relativno kratek peptid, ki je ciljal HPV16 E6 in E7 epitope. Kot naslednje pa so oblikovali dve vrsti LP cepiva. Eno od teh je bilo short-term LP (ST-LP) in je vsebovalo HPV16 E5, E6 in E7 epitope. Skupaj s ST-LP cepivom so injicirali imunski adjuvant CpG-oligodeoksinukleotid (ODN). Nemetilirani CpG motiv lahko aktivira B celice, aktivira monocite in inducira produkcijo citokina Th1. Predvidevali so, da novo ST-LP cepivo cilja več ključnih HPV karcinogenih antigen-epitopov kot kratki-peptid cepivo. To vodi do imunološke tolerance. Drugo LP cepivo so oblikovali z namenom izboljšanja imunogenosti. To so poskušali narediti s fuzijo s rAAV. RAAv vektor razširi in podaljša učinek cepiva. Ko so injicirali virusne delce v miši, so z virusom okužene celice persistentno proizvajale peptid cepivo. Na koncu so oblikovali novo strategijo, imenovano "priming-boosting", pri kateri so ST-LP cepivo injicirali večkrat, da so pripravili sistem. Nato so injicirali LT-LP, ki je ojačilo in podaljšalo dolgotrajni imunski odgovor. Za napoved epitopov so uporabili štiri različne podatkovne baze, BIMAS, Epitope-Prediction, TAPPred in ProPred. Izbrali so štiri najvišje uvrščene H-2D2 vezavne epitope. V študiji so uporabljali C57BL/6 miši ženskega spola, ki so bile stare od 6 do 8 tednov. HPV16 E5/E6/E7 gene so ločeno pridobili iz plazmida PBR322-HPV16 s pomočjo reakcije PCR. Pri PCR reakciji so uporabili različne oligonukleotidne začetnike. Izolirane PCR produkte so klonirali v pGEM-Teasy vektorju. Zaporedja so nato subklonirali v plazmid, rpAAV-MCS. RpAAV-MSC so modificirali z vnosom zaporedja EGFP (green fluorescent protein) med BamHI in BgIII restrikcijski mesti. Za pripravo rpAAV-HPV16E5, E6 in E7 virusov so kotransficirali rpAAV-HPV16E5, E6 ali E7 z pAAV-RC in pHelper v 293 celic. Za pripravo rpAAV-HPV16 E5+E6+E7, kombiniranega zaporedja, so najprej sintetizirali DNA zaporedje, nato pa so na oba konca dodali restrikcijska mesta za EcoRI in BamHI. To zaporedje so potem klonirali v plazmidu, rpAAV-MCS. Število specifičnih celic T je bilo veliko večje pri miših, ki so jih cepili s LP+CpG kot pri miškah, ki so jih injicirali E5+CpG ali E6+E7+CpG. LP+CpG cepivo ustvari večjo citotoksičnost proti rTC-1 tumorskim celicam. Od časa odvisen in vivo eksperiment kaže, daje LP+CpG cepivo inhibiralo rTC-1 rast tumorja. Ti rezultati kažejo, da lahko LP+CpG cepivo specifično cilja več HPV epitopov. To se kaže v grobi, specifični, celično posredovani imunosti, sposobni napadanja in odpravljanja tumorjev.
ZAKLJUČEK
Antigen specifična cepiva so klasificirana kot DNA cepiva, peptidna cepiva in proteinska cepiva. Dobra stran je ta, da je DNA cepivo enostavno pripraviti. Peptidno cepivo je varno in lahko za proizvesti, vendar ima slabe imunogene lastnosti. Proteinsko cepivo pa ima dobro imunogenost, vendar ga je težko pripraviti in ni tako varno. Koncept cepiva dolgi peptid, "long-peptide", pa združuje prednosti obeh, peptidnih in proteinskih cepiv. Dolgi peptidi lahko vsebujejo več epitopov, specifičnih za različne MHC-molekule. Študija je pokazala uspešen sistem, kjer so imunski sistem sprožili s ST-LP in ga ojačili s LT-LP, da so dobili močan, podaljšan imunski odgovor. LP ima torej velik potencial za zdravljenje okužb s HPV16.
