PHOENICS
PHOENICS je iGEM projekt skupine Heidelberg. Za projekt je študentska skupina prejela številne nagrade, med drugim so pridobili naziv najboljšega projekta na področju onkologije, nagado za najboljši model, zbirko delov ...
Uvod
Solidni oziroma trdni tumorji predstavljajo večino primerov raka po svetu in so glavni vzrok smrti zaradi rakavih obolenj. Tumorji tega tipa so pogosto obdani s kompleksnim tumorskim mikrookoljem, ki vključuje gosto ekstracelularno matriko, veliko celično heterogenost in imunosupresivne signale. Takšno okolje otežuje prehod imunskih celic v tumor, pri čemer je zmanjšana tudi učinkovitost ciljno usmerjenih terapij. Velik izziv pri zdravljenju trdnih tumorjev predstavlja tudi dejstvo, da številne pomembne signalne molekule v tumorskem okolju nastopajo v obliki topnih ligandov in citokinov, ki ustvarjajo lokalno tumorsko nišo. Receptorske celične terapije, ki takšne topne signale zaznajo, pa lahko povzročijo neželeno sistemsko aktivacijo imunskega sistema tudi v zdravih tkivih. Zaradi tega se lahko pojavijo resni stranski učinki, ki vključujejo pretirano sproščanje citokinov in imunsko preobčutljivost.
Opis projekta
Na podlagi omenjenega so razvili PHOENICS. Gre za sintetično imunsko celico, ki temelji na povezovanju sintetičnih receptorjev s fosforilacijskimi signalnimi potmi, kar omogoča hitro in natančno zaznavanje signalov v tumorskem mikrookolju. Sistem uporablja dva tipa receptorjev, in sicer aktivacijske receptorje, ki sprožijo kinazno aktivnost in inhibitorne receptorje, ki aktivirajo fosfataze. S tem sistem izvaja logiko AND/NOT, saj se bo terapevtski odziv sprožil le ob prisotnosti tumorskega signala in hkratni odsotnosti inhibitornih signalov nerakavih tkiv. Takšen pristop zmanjšuje možnost neželene sistemske aktivacije imunskega sistema in preprečuje učinke »on target/off-tumor«.
Posebnost platforme je tudi hitra znotrajcelična obdelava signalov preko reverzibilnih fosforilacijskih reakcij, ki omogočajo hitrejši odziv kot klasični transkripcijski sistem. Po aktivaciji celice pride do takojšnjega sproščanja terapevtskih proteinov, ki so že predhodno prevedeni in shranjeni v endoplazemskem retikulumu. Med eksperimentalno potrjenimi tarčami sistema so signalne molekule VEGF in TNF-⍺, kot efektor pa je bil uporabljen citokin IL-12.
Pomemben del projekta pa je predstavljal tudi SPARC (angl. Simulator for Phosporyliation And Receptor Characterization). Ta omogoča simulacijo receptorskih interakcij, optimizacijo signalnih vezij in načrtovanje novih proteinskih vezavnih partnerjev še pred eksperimentalnim testiranjem.
Eksperimentalni del
Sistem je v splošnem sestavljen iz treh ključnih korakov, in sicer zaznavanja, procesiranja in celičnega odziva.
Zaznavanje
Na podlagi receptorja KORD (κ-opioidni receptor DREADD), modificiranega GPCR receptorja, ki ga aktivira salvinorin B (SalB), je bil razvit modularni receptorski sistem PAGER (angl. Programmable Antigen-Gated Engineered G Protein-coupled Receptor). Končni konstrukt PAGER-ABL temelji na receptorju KORD-ABL, kjer je C-terminalni del receptorja povezan s SynKinazo oziroma skrajšano kinazo ABL, ki omogoča prostorsko odvisno fosforilacijo sintetičnega substrata CD3ζ. Poleg tega konstrukt vsebuje zunajcelično nanotelesčno domeno, povezano s peptidnim antagonistom Arodyn, ki receptor ohranja v inhibiranem stanju. Ob vezavi tumorskega liganda, kot je VEGF, pride do odstranitve Arodyna z vezavnega mesta receptorja, kar omogoči vezavo SalB in aktivacijo receptorja. Posledična konformacijska sprememba sproži fosforilacijo CD3ζ preko β-Arrestin2-posredovane rekrutacije signalnih komponent, kar vodi do nastanka transkripcijskega aktivatorja in izražanja transgena. Sistem omogoča hitro, reverzibilno in zelo modularno zaznavanje topnih ali membransko vezanih ligandov, pri čemer lahko z zamenjavo zunajcelične nanotelesčne domene receptor prilagodimo različnim tumorskim tarčam. Zaradi ortogonalne signalizacije, nizke bazalne aktivnosti in možnosti kombinatornega procesiranja signalov predstavlja PAGER-ABL pomemben napredek pri razvoju prilagodljivih sintetičnih celičnih terapij za zdravljenje solidnih tumorjev.
Za razširitev sistema PHOENICS je študentska skupina razvila modularni receptorski sistem MESA (angl. Modular Extracellular Sensing Architecture), ki omogoča zaznavanje tako majhnih molekul kot tudi topnih proteinskih ligandov. Končni sistem temelji na kombinaciji stimulativnih TNFα receptorjev s kinazno domeno ABL in inhibitornih receptorjev s fosfatazo PTPN1, katerih aktivacija je odvisna od prisotnosti rapaloga. Rapalog je sintetično razvit analog rapamicinu, ki se v sintezni biologiji uporablja kot molekulsko stikalo. Ob ustrezni kombinaciji signalov pride do fosforilacije oziroma defosforilacije regulatornega substrata CD3ζ, kar določa, ali se bo transkripcijski faktor ponovno sestavil in sprožil izražanje genov. Na podlagi matematičnega modeliranja platforme SPARC so optimizirali razmerja med receptorji ter ustvarili celični sistem, pri katerem se izražanje genov aktivira le, kadar stimulativni signal TNFα prevlada nad inhibitornim signalom rapaloga. Takšna zasnova omogoča natančno procesiranje več signalov hkrati, dodatno varnost pri delovanju sistema ter boljši nadzor celičnih odzivov v kompleksnem tumorskem mikrookolju.
Procesiranje
Sintetična signalna vezja predstavljajo pomemben pristop pri razvoju naprednih celičnih terapij, saj omogočajo natančno zaznavanje in procesiranje signalov v celici. Platforma PHOENICS temelji na sintetičnem paru kinaza–fosfataza, ki uravnava fosforilacijsko stanje substrata in s tem vezavo proteina SH2 ter nadaljnje celične odzive. Fosforilacija poteka specifično le v prisotnosti sintetične kinaze, interakcija med SH2 in substratom pa je reverzibilna in odvisna od koncentracije signalnih komponent – višje koncentracije kinaze povečajo nastanek kompleksa, medtem ko fosfataza njegovo stabilnost zmanjšuje.
Študentska skupina je najprej preverila, ali lahko sintetična kinaza (SynKinaza), ki temelji na skrajšani kinazi ABL, učinkovito fosforilira sintetični substrat (SynSubstrat). S pomočjo metode Western blot so dokazali, da prostorska bližina med SynKinazo in SynSubstratom, omogočena preko interakcij med dvojnimi vijačnicami, vodi do učinkovite fosforilacije substrata. Za dodatno preverjanje ortogonalnosti sistema so uporabili protitelesa anti-pY, specifična za fosforilirane tirozinske ostanke znotraj motivov ITAM, medtem ko so prisotnost substrata v vzorcih potrdili z Myc-oznako in barvanjem z anti-Myc protitelesi.
Za delovanje sistema PHOENICS pa je ključna tudi učinkovita dimerizacija med fosforiliranim SynSubstratom in proteinom SH2 ter njuna ponovna ločitev ob defosforilaciji, saj ta proces omogoča nastanek fosforilacijsko odvisnega signalnega odziva. Skupina je tako dimerizacijo preučevala s sistemom splitFAST, ki temelji na razdeljenem fluorescenčnem proteinu in omogoča neposredno spremljanje proteinsko-proteinskih interakcij. Sistem predstavlja razdeljeno različico proteina RspA-FAST, ki fluorescira v prisotnosti majhne molekule HMBR, zaradi nizke spontane samosestavitve in velikega dinamičnega območja pa je posebej primeren za spremljanje interakcij med proteini. Rezultati so pokazali, da povečanje koncentracije SynKinaze vodi do večje dimerizacije med CD3ζ in SH2, medtem ko SynFosfataza ta učinek postopno zmanjšuje, kar potrjuje reverzibilno in koncentracijsko odvisno regulacijo signalnega sistema.
Odziv sistema
Na podlagi osnovnih procesnih modulov sistema PHOENICS so študentje razvili dva efektorska sistema, ki omogočata pretvorbo fosforilacijskih signalov v reverzibilne funkcionalne odzive celice.
Prvi sistem temelji na regulaciji izražanja genov. Pri tem so DNA-vezavno domeno GAL4DBD povezali s sintetičnim substratom (SynSubstrat), domeno SH2 pa s transkripcijskim aktivatorjem VP64. Ko SynKinaza fosforilira CD3ζ, se SH2-VP64 veže na fosforilirani substrat, kar omogoči ponovno sestavo funkcionalnega transkripcijskega faktorja GAL4DBD-VP64 in posledično aktivacijo izražanja reporterskega proteina NanoLuciferaze. Nasprotno pa SynFosfataza povzroči defosforilacijo CD3ζ, prepreči vezavo SH2-VP64 in s tem zavre izražanje genov. Sistem se je izkazal za občutljivega na spremembe koncentracij kinaze in fosfataze ter omogoča natančno regulacijo signalnega odziva.
Poleg transkripcijskega sistema so razvili tudi sistem RELEASE, ki omogoča hitro izločanje proteinov na posttranslacijski ravni. V ta namen so zasnovali fosforilacijsko inducirano proteazo TEV (PhosphoTEV) v dveh različicah. V prvi različici je bila proteaza razdeljena na dva dela: N-terminalni del je bil povezan z domeno SH2, C-terminalni del pa s SynSubstratom in domeno bZipRR. Slednja domena temelji na motivu levcinske zadrge in ima v sistemu vlogo povezovalnega elementa. V drugi različici so oba dela povezali v enoten konstrukt s poltogo povezovalno regijo. V obeh primerih fosforilacija SynSubstrata omogoči vezavo SH2 in ponovno sestavo aktivne TEV proteaze. Aktivirana proteaza nato sproži sproščanje predhodno sintetizirane NanoLuc luciferaze, katere izločanje so lahko merili v supernatantu. Takšen pristop omogoča hiter, reverzibilen in natančno reguliran celični odziv.
Zaključek
Projekt PHOENICS predstavlja napreden pristop na področju celičnih terapij, saj vključuje modularno zaznavanje signalov, fosforilacijsko procesiranje informacij in hitro reverzibilno izvajanje celičnih odzivov. Sistem poleg tega temelji na uravnavanju aktivnosti sintetičnih kinaz in fosfataz, kar omogoča natančno procesiranje signalov iz tumorskega mikrookolja, pri čemer ima manjšo možnost nastanka neželenih učinkov v zdravih tkivih. Sistem PHOENICS torej predstavlja obetavno osnovo za razvoj personalizitanih celičnih terapij v prihodnosti, predvsem za zdravljenje trdnih oziroma solidnih tumorjev, kjer so obstoječe terapije pogosto omejene zaradi same kompleksnosti tumorskega mikrookolja.
Viri
"Heidelberg - IGEM 2025.” https://2025.igem.wiki/heidelberg/ (pridobljeno 16. maj 2026)
A. H. Kuerec in A. B. Maier, “Why is rapamycin not a rapalog?,” Gerontology, vol. 69, št. 6, pp. 657–659, Jan. 2023, doi: 10.1159/000528985. (pridobljeno 16. maj 2026)
