Pepcitrus
Uvod
Citrusi so ena najpomembnejših skupin sadnih rastlin, med katerimi imajo posebno mesto pomaranče kot vir vitaminov, mineralov, vlaknin in bioaktivnih spojin. Po podatkih projekta Pepcitrus se v Braziliji proizvede približno 70 % svetovnega pomarančnega soka in 29 % svežih pomaranč, namenjenih globalni porabi. Bolezni citrusov zato niso le biološki problem, temveč tudi gospodarska in družbena grožnja. Eden glavnih izzivov v citrusni industriji so bakterijski in glivni patogeni. Projekt Pepcitrus se osredotoča na tri bolezni: greening oziroma Huanglongbing, ki ga povzročajo bakterije iz rodu Candidatus Liberibacter, ter bolezni green mold, ki ga povzroča Penicillium digitatum, in sour rot, ki ga povzroča Geotrichum candidum. Greening prizadene drevesa že v nasadu in s tem ogroža dolgoročno produktivnost nasadov, medtem ko green mold in sour rot povzročata izgube med skladiščenjem, transportom in prodajo plodov. Obstoječe metode nadzora pogosto vključujejo uporabo pesticidov, odstranjevanje okuženih dreves in fungicidno obdelavo plodov, pri čemer se pojavljajo vprašanja učinkovitosti, razvoja odpornosti, stroškov in vpliva na okolje.
Opis projekta
Projekt Pepcitrus kot možno rešitev za bolezni citrusov predlaga uporabo 21 aminokislin dolgega antimikrobnega peptida CTX, prvotno opisanega pri južnoameriški drevesni žabi Hypsiboas albopunctatus. Mehanizem delovanja vključuje vezavo pozitivno nabitega peptida na membrano mikroorganizma in tvorbo por. Posledica je izguba celovitosti membrane, uhajanje celične vsebine in smrt patogena. Ker bi bila za uporabo v kmetijstvu potrebna proizvodnja večjih količin peptida, projekt ni ostal le pri testiranju njegove aktivnosti, temveč je razvil strategije za njegovo rekombinantno izražanje v gensko spremenjenih mikroorganizmih. Ekipa je kot možne gostitelje obravnavala Escherichio coli, Saccharomyces cerevisiae in Aspergillus oryzae. Te komplementarne ekspresijske platforme so omogočile primerjavo učinkovitosti in ekonomske izvedljivosti proizvodnje.
Eksperimentalni del
Proizvodnja CTX v E. coli
Glavni izziv pri proizvodnji antimikrobnega peptida CTX je, da deluje toksično tudi na proizvodne mikroorganizme. Ena izmed glavnih strategij za preprečevanje tega problema je bila fuzija CTX s sfGFP, ki je stabilen, dobro topen, fluorescenčni reporterski protein. Ko je CTX povezan s sfGFP, je njegova protimikrobna aktivnost zmanjšana oziroma prikrita, kar olajša proizvodnjo v gostiteljskih celicah. V konstrukt so vključili tudi fleksibilni povezovalni del 3 × GS linker, ki omogoča prostorsko ločitev CTX od sfGFP, dve cepitveni mesti za proteazo TEV, ki obdajata CTX in omogočata njegovo natančno sprostitev, ter His-oznako, ki omogoča čiščenje proteina z IMAC afinitetno kromatografijo. Za izražanje konstrukta pIGEM001–sfGFP–CTX v E. coli so uporabili osnovni ekspresijski vektor pJL1–sfGFP in insert K7-CTX, ki so ga pomnožili iz plazmida pUC K7CTX. Ekspresijski vektor so razdelili na dva fragmenta, da so olajšali PCR-amplifikacijo, nato pa so fragmente skupaj z insertom sestavili z metodo NEBuilder HiFi DNA Assembly. Ta metoda omogoča sestavljanje DNA-fragmentov s prekrivajočimi se homolognimi konci. S tako pripravljenim konstruktom so transformirali E. coli. Iz 1 L kulture so po IMAC afinitetni kromatografiji pridobili približno 20 mL očiščenega sfGFP–CTX. Po čiščenju je cepitev s proteazo TEV omogočila pridobitev majhnega CTX brez dodatnih oznak. Ker je CTX majhen peptid, približno 2,3 kDa, nosilni proteinski fragmenti pa so bistveno večji, približno 30 kDa, so izvedli ločevanje z ultrafiltracijo skozi membrano z mejo prehajanja 10 kDa. V filtratu, ki je vseboval CTX, so z merjenjem UV-absorbance kvantificirali približno 2 mg očiščenega CTX na liter kulture.
Proizvodnja CTX v A. oryzae
Za ekspresijo sfGFP–CTX v filamentozni glivi Aspergillus oryzae so izhajali iz že pripravljenega konstrukta pIGEM001, iz katerega so s PCR pomnožili fragment sfGFP–CTX. Pri tem so uporabili začetne oligonukleotide s homolognimi regijami za vstavitev v plazmid pUC57-IS1, in sicer v regijo IS1. Hkrati so pUC57-IS1 linearizirali z začetnimi oligonukleotidi, ki so prav tako vsebovali homologijo z insertom. Potrjeni konstrukt pIGEM002, pripravljen v predhodnem klonirnem koraku z E. coli, so uporabili za transformacijo A. oryzae seva Ory7. Pred transformacijo so plazmid pIGEM002 razgradili z encimom SwaI in sprostili donorski DNA-fragment velikosti približno 3,5 kbp, namenjen homologni rekombinaciji v A. oryzae. Transformacija je bila izvedena po protokolu, ki temelji na pripravi protoplastov, vnosu DNA s pomočjo PEG–CaCl₂ postopka in CRISPR/Cas-usmerjeno integracijo, pri čemer se prekine gen uidA. Po transformaciji so še preverjali transformante s potrditvenim PCR in naredili test ekspresije oziroma sekrecije sfGFP–CTX z SDS-PAGE in merjenjem fluorescence reporterskega GFP. Na podlagi kvantifikacije proteinov so ocenili sekrecijo približno 100 mg/L sfGFP–CTX. Čeprav niso imeli dovolj časa za čiščenje CTX iz sekretoma, bi bil to naslednji logični korak projekta. Ker CTX predstavlja približno 10 % mase sfGFP–CTX, to ustreza približno 10 mg/L CTX, kar je petkrat več kot pri E. coli. To je bilo doseženo že pri statični tekočinski kultivaciji, kar nakazuje, da bi se lahko izkoristki še bistveno izboljšali pri fermentaciji z mešanjem. Proizvodnjo sfGFP–CTX so potrdili v obeh gostiteljih, E. coli in A. oryzae, kar kaže, da je strategija fuzije uspešna za prikrivanje toksičnosti peptida, ohranjanje rasti gostitelja in kasnejšo pridobitev CTX po cepitvi. Kljub temu so koraki cepitve s proteazo in nadaljnjega čiščenja lahko dragi in manj primerni za proizvodnjo v večjem merilu, zato je ekipa razvila alternativno strategijo v kvasovki Saccharomyces cerevisiae.
Proizvodnja CTX v S. cerevisiae
Pri kvaskovki S. cerevisiae so namesto znotrajceličnega izražanja uporabili pristop izražanja na površini. Za pripravo konstrukta so prejemni vektor razrezali z restrikcijskim encimom XhoI, zaporedje CTX pa pomnožili iz pIGEM001. Pri tem so insertu z začetnimi oligonukleotidi dodali mesti XhoI na 5′ in 3′ koncu, na 3′ koncu pa tudi zaporedje za SNAC-Tag. Fragmente so nato ligirali s T4-ligazo, konstrukt preverili v E. coli in ga uporabili za transformacijo S. cerevisiae. Na ta način so CTX povezali s sistemom za površinski prikaz preko Aga1p, ki je zasidran v celično steno kvasovke prek GPI-sidra. Uporaba SNAC-Tag je omogočila sprostitev CTX s površine celic v supernatant s kemijsko cepitvijo v prisotnosti Ni²⁺ ionov. Na podlagi meritev so ocenili, da bi bil izkoristek CTX lahko primerljiv z izkoristkom pri A. oryzae, kar podpira uporabo tega ekspresijskega sistema za bolj ekonomsko izvedljivo proizvodnjo CTX.
Optimizirana proizvodnja CTX v A. oryzae
Kot dodatno strategijo za povečanje proizvodnje CTX je ekipa ponovno uporabila Aspergillus oryzae, vendar tokrat CTX niso povezali s sfGFP, temveč z naravno močno izločanimi amilazami A, B in C. Modul K7–CTX so želeli vstaviti na C-konec vsake amilaze. Tako bi gliva še naprej proizvajala in izločala svoje naravne amilaze, hkrati pa bi bil nanje vezan tudi CTX. Za usmerjeno vstavitev so uporabili pristop CRISPR/Cas9 in homologno rekombinacijo z uporabo dveh gRNA, kjer ena tarči sredino gena, druga pa blizu stop kodona. Strategija dvojnega tarčenja je bila namenjena povečanju verjetnosti uspešne cepitve DNA in vstavitve donorske DNA. Prav tako so za preprečevanje ponovne cepitve po integraciji v zaporedje uvedli mutacijo W369F, ki pa je relativno konzervativna, saj sta obe aminokislini aromatski in hidrofobni. Kandidatne transformante so preverili s PCR, vendar v tem ciklu projekta uspešne integracije niso potrdili, kar kaže, da bi bilo treba sistem dodatno optimizirati, na primer izbiro gRNA ali pogoje transformacije. Kljub temu je strategija pomembna, ker izkorišča naravni sekrecijski potencial A. oryzae. Potencialno bi lahko omogočila učinkovitejšo proizvodnjo CTX in povezavo s fermentacijo v trdnem stanju (SSF) na pomarančnih olupkih z ocenjenim izkoristkom 830 mg CTX na kilogram pomarančnih olupkov. Tak pristop bi lahko dodatno zmanjšal proizvodne stroške in izboljšal okoljsko trajnost celotnega procesa.
Podporni računalniški model
Kot podporo eksperimentalnemu delu je ekipa razvila računalniški model širjenja okužbe greening v floemu, v katerega so vključili tudi obrambni odziv rastline in terapevtski učinek protimikrobnih spojin. S tem so lahko primerjali različne tipe ukrepanja, pri čemer so CTX modelirali kot baktericidno učinkovino, oksitetraciklin pa kot že preučevano antibiotično možnost z bakteriostatičnim učinkom. Model je tako služil kot virtualni laboratorij za preverjanje CTX kot potencialne terapije za že okužena drevesa.
Diagnostika
Poleg terapevtskega pristopa s CTX so v sklopu projekta razvili tudi diagnostično orodje, imenovano Sniffer. Zgodnja in zanesljiva diagnostika je pri bolezni Greening ključna, saj se okužena drevesa pogosto odkrijejo šele, ko je bolezen že razširjena. Klasične molekularne metode, kot je qPCR, so sicer natančne, vendar so časovno zahtevne, dražje in odvisne od laboratorijske infrastrukture, zato so želeli razviti bolj dostopen diagnostični pristop, ki bi bil uporaben tudi bližje mestu pridelave. Orodje Sniffer zaznava hlapne organske spojine, ki jih oddajajo listi citrusov. Ker okužba spremeni metabolno stanje rastline, se spremeni tudi njen kemijski profil. Na podlagi meritev zdravih in okuženih listov ter analize s strojnim učenjem je prototip uspešno razlikoval med obema skupinama. Kljub obetavnim rezultatom sistem še ni pripravljen za terensko uporabo, saj bi potreboval večji nabor podatkov, validacijo v različnih okoljskih pogojih in dodatne tehnične izboljšave.
Zaključek
Rešitev projekta Pepcitrus ni le uporaba antimikrobnega peptida CTX, temveč celovit pristop sintezne biologije, ki vključuje načrtovanje genskega konstrukta, izražanje v različnih mikroorganizmih, testiranje njegove učinkovitosti in razvoj podpornega diagnostičnega orodja. CTX predstavlja obetavno alternativo za nadzor bolezni citrusov, še posebej v povezavi s proizvodnjo v A. oryzae in uporabo pomarančnih olupkov kot substrata. Kljub temu so za dejansko uporabo potrebne še dodatne raziskave, kot so testi na plodovih in rastlinah v realnih pogojih, ocena stabilnosti peptida, vpliva na netarčne mikroorganizme ter stroškov proizvodnje v velikem obsegu.
Literatura
(1) iGEM Teams. https://teams.igem.org/5560 (accessed 2026-05-10).
