Povečanje proizvodnje lipidov v kvasovki Yarrowia lipolytica

UVOD

Biodizel danes pridobivamo skoraj izključno iz rastlinskih olj in živalske maščobe. Proizvodnja tako tekmuje s pridelavo hrane in porablja velike količine vode, gnojil in pesticidov. Zato se je kot alternativa začela razvijati mikrobna proizvodnja olj iz celulozne biomase različnega izvora. Trenutno najbolj obetaven pristop je metabolno inženirstvo heterotrofnih mikrobov. Da bi biodizel lahko pridobivali na industrijski ravni, je potrebno izboljšati izkoristek pretvorbe ogljikovih hidratov v maščobe. Težavo pri tem predstavlja nepoznan metabolizem uporabljanih organizmov, kot je regulacija sinteze maščobnih kislin in skladiščenja lipidov. Dosedanje raziskave so bile usmerjene v povečanje sinteze maščobnih kislin, večjo zalogo prekurzorjev ter spreminjanje fermentacijskih pogojev, niso pa se ukvarjali z alosterično inhibicijo z nasičenimi maščobnimi kislinami. Mikrobni organizem, uporabljen v raziskavi, je Yarrowia lipolytica – kvasovka, ki je sposobna shranjevanja znatne količine lipidov. Pod posebnimi pogoji se sproži tudi visoka pretvorba ogljikovega vira v maščobe, vendar pa ne pride do optimalnega znotrajceličnega shranjevanja, kar nakazuje na regulatorni mehanizem.

CILJ RAZISKAVE

Da bi ohranili visoko proizvodnjo maščobnih kislin v kvasovki Y. lipolityca in se izognili mehanizmom alosterične inhibicije, so želeli povečati pretvorbo nasičenih v mononenasičene maščobne kisline. Poiskati je bilo treba metabolični regulator, ki to omogoča – identificirali so ga v sesalskih maščobnih celicah – ter ga izraziti v kvasovki.

POTEK RAZISKAVE IN REZULTATI

Da bi našli regulatorje metabolizma lipidov, so z uporabo metode SAGE (serijska analiza genske ekspresije) primerjali izražanje genov povezanih z metabolizmom v tkivih, ki shranjujejo maščobo (maščobno tkivo in jetra) ter v tkivih, ki maščobe ne shranjujejo (srce in pljuča). Tako so identificirali stearoil-CoA-desaturazo (SCD), ki katalizira ∆9-desaturacijo palmitoil-CoA in stearoil-CoA. SCD so nato nadizrazili v divjem tipu Y. lipolytica, vendar jim ni uspelo povečati količine lipidov. V naslednjem koraku so SCD nadizrazili v MTYL065 – to je sev Y. lipolytica, kjer sta nadizražena tudi ACC1 in DGA1 – proteina v metabolizmu lipidov. Novodobljeni sev YL-hr3 pa je vseboval tudi druge mutacije, zato so oblikovali nov sev YL-ad9. Dobili so ga tako, da so v osnovnem sevu Y. lipolytica (po1g) nadizrazili vse tri omenjene gene. Kvasovke YL-ad9 so rasle hitreje od divjega tipa in so imele večjo vsebnost lipidov, poleg tega pa so imele večjo toleranco na glukozo. Ti rezultati so pokazali, da je povečan fluks mononenasičenih maščobnih kislin povezan s povečanjem znotrajceličnega shranjevanja triacilglicerolov ter da ima gen SCD regulatorno vlogo v metabolizmu lipidov tako pri sesalcih kot tudi pri enostavnih evkariontih. Sev YL-ad9 so preizkusili v dohranjevalni šaržni fermentaciji v mediju, ki je imel kot edini vir ogljika glukozo. Glede na divji tip se je rast v eksponentni fazi povečala štirikrat. Proizvodnja nevtralni lipidov je bila največja med stacionarno fazo in je znašala2,5 g/L. Spremenila se je tudi sestava lipidov: bilo je 71% oleinske kisline in 8% palmitoleinske kisline. Visoka vsebnost oleinske kisline je zaradi dobrih lastnosti pri prozvodnji biogoriv zaželjena. Izkoristek pretvorbe sladkorja v lipide je bil 0,234 g/g, kar je 84,7% teoretičnega maksimuma. Zaradi večje rasti in tolerance na glukozo se je čas fermentacije zmanjšal iz 120-144 h na 78 h. Celukupna produktivnost je bila 0,707 g/L/h. Ker naj bi se biodizel proizvajalo iz biomase oz. alternativnih virov ogljika, so z YL-ad9 izvedli še šaržno fermentacijo na celulozni rastlinski biomasi in surovem glicerolu. Celulozno biomaso, ki je bila predhodno obdelana s kislino, so izpostavili encimski hidrolizi, nato pa izvedli fermentacijo. Dosegli so izkoristek 0,14 g/g TAG. Na surovem glicerolu je bil izkoristek večji: 0,23 g/g TAG. Raziskali so tudi mehanizem preoblikovanja citoplazme, ki je potrebno za shranjevanje tolikšne količine lipidov. Z uporabo inhibitorjev avtofagije so pokazali, da je ta nujno potrebna za kopičenje TAG.

ZAKLJUČEK

V raziskavi so identificirali ohranjen regulator metabolizma lipidov iz sesalcev, ki pa lahko podoben fenostip sproži tudi pri kvasovkah. Za visoko proizvodnjo lipidov morata biti poleg SCD nadizražena še ACC1 in DGA1. Spremenjeni sev Yarrowia lipolytica – YL-ad9 je pokazal hitrejšo rast, večjo toleranco na sladkorje in produktivnost 22 kg/m3/dan, kar je približno 11-krat bolje od divjega tipa. Kljub temu pa je to le tretjina volumetrične produktivnosti etanola, zato bodo potrebne nadaljnje izboljšave.