Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze

Izhodiščni članek: Rewiring central metabolism in Komagataella phaffii for efficient mannose synthesis

Uvod

D-manoza je monosaharid, ki je epimer D-glukoze in se razlikuje na C-2 mestu. V naravi je prisotna kot manan, polisaharid iz D-manoze, ki je prisoten v rastlinah (hemiceluloza) in pomemben sestavni del celičnih sten kvasovk. D-manoza se nahaja tudi v človeškem serumu. Uporabljajo jo v farmaciji, prehrambeni industriji in v kozmetiki. Pogosto se uporablja pri zdravljenju blažjih okužb sečil. Potrebe po D-manozi so velike, njena proizvodnja pa draga [1–3]. Večina D-manoze se pridobi iz rastlin z ekstrakcijo, kjer je problem omejenost z viri in izolacijo iz manana. Lahko se jo sintetizira s kemijsko izomerizacijo glukoze ali z oksidacijo manitola. Pri tem se uporabljajo nevarne kemikalije. Pridobi se jo lahko tudi z encimsko katalitsko konverzijo iz D-fruktoze. Ta postopek je zelo specifičen z malo stranskih produktov, vendar je drag. Zato so avtorji članka poskušali najti alternativo, pri kateri bi mikroorganizmi sintetizirali D-manozo [2].

Priprava mikrobnih celičnih tovarn

To so poskušali doseči z mikrobnimi celičnimi tovarnami, ki so mikroorganizmi, ki jih preoblikujemo tako, da proizvajajo določeno spojino. Tovarna se imenuje, ker temelji na konceptu, da iz surovine s procesom dobimo produkt. Celice iz reaktanta naredijo produkt. Najprej moramo izbrati mikroorganizem, ki ga imenujemo šasija. To je osnova, na kateri izvajamo spremembe, ki jih uvedemo z uporabo sintezne biologije. Potem spreminjamo gene tega mikroorganizma, saj želimo, da se čim več substrata pretvori v produkt. To po navadi naredimo tako, da spreminjamo metabolizem mikroorganizma. S tako mikrobno celično tovarno lahko nek produkt naredimo cenejše in bolj okolju prijazno [4, 5].

V tem članku so naredili mikrobno celično tovarno, ki je proizvajala D-manozo. S tem so želeli ustvariti alternativo dosedanjim metodam pridobivanja D-manoze. Kot šasijo so si izbrali kvasovko Komagataella phaffii. Gre za metilotrofno kvasovko, ki se je včasih imenovala Pichia pastoris. Je drugi najbolj uporabljen organizem za sintezo proteinov po E. coli. K. phaffii je zelo učinkovit evkariontski ekspresijski sistem. Uporaben je zaradi posttranslacijskih modifikacij, poceni gojenja, pravilnega zvijanja proteinov in zmožnosti fermentacije pri visoki gostoti celic. Je prepoznana kot GRAS (Generally Recognized as Safe) [2, 6, 7].

Metabolizem K. phaffii, povezan s sintezo D-manoze

D-glukoza se v K. phaffii porablja v procesu glikolize. Iz glukoze nastane po vrsti glukoza-6-fosfat, fruktoza-6-fosfat in fruktoza-1,6-bisfosfat. Iz fruktoze-6-fosfata lahko pridobimo tudi D-manozo, preko manoze-6-fosfata. Prav tako gre lahko glukoza-6-fosfat v pentoza fosfatno pot (PPP), ki je alternativna pot razgradnje glukoze. Ta se lahko pretvori v ribozo-5-fosfat in ribulozo-5-fosfat, ki se lahko preko redukcijskih reakcij pretvorita v ribitol in arabinitol. Pentoza fosfatna pot zmanjšuje nastanek D-manoze, saj odvzema glukozo-6-fosfat in zato nastaja manj fruktoze-6-fosfata in posledično D-manoze. Glicerol lahko vstopa v celice posebej in vstopi v proces glikolize s pretvorbo glicerola v glicerol-3-fosfat in potem v DHAP (dihidroksiaceton fosfat). Ta je tudi naslednja stopnja pretvorbe fruktoze-1,6-bisfosfata v glikolizi in tako glicerol preko pretvorbe vstopi v glikolizo [2].

Priprava K. phaffii, ki proizvaja povečano koncentracijo D-manoze

Raziskovalci so proizvodnjo D-manoze v kvasovki želeli doseči s preoblikovanjem metabolizma s sistemom dveh virov ogljika, glicerol za rast celične biomase in glukozo izključno za sintezo D-manoze. Ker so želeli proizvajati D-manozo, so morali povečati pot iz fruktoze-6-fosfata v D-manozo, torej so v prvi stopnji morali povečati koncentracijo fruktoze-6-fosfata. Zato so morali zmanjšati pentoza fosfatno pot in pretvorbo fruktoze-6-fosfata v fruktozo-1,6-bisfosfat, saj ti reakciji zmanjšujeta kopičenje fruktoze-6-fosfata. Pri pentoza fosfatni poti glukoza-6-fosfat dehidrogenaza (gen zwf1) omogoča oksidativno dekarboksilacijo glukoze-6-fosfata. Pretvorbo fruktoza-6-fosfata v fruktoza-1,6-bisfosfat katalizirata fosfofruktokinaza 1 in 2 (gena pfk1 in pfk2). Da bi povečali koncentracijo fruktoze-6-fosfata, so zmanjšali izražanje genov pfk1 in zwf1 z zamenjavo promotorja v glicerol-inducibilnega PGUT1, ki je šibkejši promotor. Izvedli so tudi delecijo gena pfk2. Tako so zmanjšali pentoza fosfatno pot ter pretvorbo v fruktozo-1,6-bisfosfat. Uspešnost spremembe genoma so analizirali z rastjo celic v prisotnosti glukoze ali glicerola. Merili so OD600. M0 je bil izhodni sev, sev M1 je vseboval delecijo gena pfk2 in zmanjšano ekspresijo pfk1, medtem ko je imel sev M2 dodatno še zmanjšano ekspresijo zwf1. Rezultati kažejo, da mutirani sevi rastejo podobno kot izhodni sev na glicerolu, vendar bistveno počasneje na glukozi. Tako so uspešno naredili sev, ki kot vir ogljika za rast porablja glicerol [2].

Potem so želeli povečati sintezo D-manoze. Menili so, da jo bodo povečali, če bodo prekomerno izrazili gen za fosfomanozno izomerazo (PAS_chr3_1115). Ta encim katalizira reverzibilno izomerizacijo med fruktozo-6-fosfatom in manozo-6-fosfatom. Torej, bi se v takem spremenjenem sevu, morala povečati koncentracija manoze-6-fosfata, ki bi se pretvarjal v D-manozo in s tem bi nastalo več D-manoze. Vendar pa so pri sevu M3, v katerem so gen PAS_chr3_1115 konstitutivno prekomerno izrazili, opazili, da se je koncentracija D-manoze najprej povečala, potem pa drastično zmanjšala. To je posledica reverzibilne aktivnosti fosfomanozne izomeraze, ki omogoča pretvorbo manoze-6-fosfata nazaj v fruktozo-6-fosfat in vstop v glikolizo, kar prepreči povečano sintezo D-manoze. Pretvorbo manoze-6-fosfata v D-manozo katalizirajo fosfataze. Na začetku je nastalo veliko proste D-manoze, ki so jo heksokinaze fosforilirale v manozo-6-fosfat. To pa je fosfomanozna izomeraza pretvorila nazaj v fruktozo-6-fosfat, ki se je porabila v glikolizi [2].

Zato so raziskovalci v naslednjem koraku zmanjšali izražanje gena za fosfomanozno izomerazo. Promotor, ki regulira izražanje fosfomanozne izomeraze, so zamenjali za šibek promotor PGUT1. Že pri M2 so ugotovili, da nastajata stranska produkta ribitol in arabinitol. Zato so izbili tudi 3 alditol dehidrogenazne gene. Pokazali so, da so s tem zelo zmanjšali sintezo arabinitola, vendar povečali sintezo ribitola. Tako spremenjen sev M4 je proizvajal veliko večjo količino D-manoze kot sev M2, saj so zmanjšali aktivnost fosfomanozne izomeraze in zmanjšali nastanek stranskih produktov [2].

Nato so želeli optimizirati še nastanek D-manoze iz manoza-6-fosfata s fosfatazo. Fosfataze v Komagataella phaffii namreč niso dovolj učinkovite pri defosforilaciji manoze-6-fosfata za industrijsko proizvodnjo D-manoze. Zato so analizirali tri fosfataze iz E. coli, YniC, YbiV in YidA, ki so zmožne defosforilacije manoze-6-fosfata. Zapise zanje so vstavili v ekspresijske vektorje in izvedli elektroporacijo v kvasovke, natančneje v sev M4. Pri prekomernem izražanju so ugotovili, da največ D-manoze nastane v sevu s fosfatazo YniC (sev M5), pri sevu M6 z YbiV pa nastane še zadovoljiva količina. Zato so ta seva še naprej analizirali [2].

Naredili so dva nova seva iz seva M4: M8, ki so mu integrirali v genom kvasovke zapis za fosfatazo YniC in M9, ki so mu integrirali gena yniC in ybiV. Pri sevu M8 nastane najvišja koncentracija D-manoze in celice kvasovk stabilno rastejo, medtem ko kombinacija obeh fosfataz ni izboljšala proizvodnje D-manoze, ker je verjetno prevelika fosfatazna aktivnost povzročila defosforilacijo drugih metabolitov, kar vodi do izgube ogljika in slabše rasti. Fosfataza YniC zagotavlja optimalno ravnotežje med pretvorbo manoze-6-fosfata v D-manozo in ohranjanjem stabilnega centralnega metabolizma, zato je bila ta fosfataza izbrana kot ključni encim za nadaljnjo optimizacijo proizvodnje. Gen yniC so integrirali v genom kvasovke pod promotorjem PGAP, ki je močni konstitutivni promotor. Odločili so se, da je sev M8 njihov končni sev [2].

Ta sev vsebuje naslednje modifikacije: delecijo gena pfk2, promotor za pfk1 in zwf1 je bil zamenjan s šibkejšim promotorjem, delecijo zapisov za 3 alditol dehidrogenaze, zamenjali so promotor gena za encim fosfomanozna izomeraza za šibkejšega in uvedli insercijo zapisa za fosfatazo YniC v kromosom kvasovke. S tem so preusmerili metabolni tok iz glikolize in pentoza fosfatne poti v sintezo D-manoze ter zmanjšali nastanek stranskih produktov. Z integracijo fosfataze YniC so omogočili učinkovito pretvorbo manoza-6-fosfata v prosto D-manozo in njeno stabilno proizvodnjo v industrijskih fermentacijskih pogojih [2].

Zaključek

Uspešnost seva so analizirali s fermentacijo v bioreaktorjih. Najprej so kvasovke rasle ob prisotnosti glicerola kot vir ogljika do celične biomase 160 g/L in v tej fazi D-manoza ni nastajala. Potem so kontrolirano dodajali glukozo, da je bila vedno med 40 in 60 g/L. V tej fazi je intenzivno nastajala prosta D-manoza in sicer 121,1 g/L D-manoze. Iz 1 grama glukoze je nastalo 0,28 g D-manoze. Nastajalo je tudi še nekaj ribitola in arabinitola. Ta koncentracija nastale D-manoze je zelo visoka in po navedbah avtorjev najvišja do zdaj poročana koncentracija sintetizirane D-manoze s fermentacijo. Tako so potrdili, da jim je uspelo pripraviti sistem dveh virov ogljika, glicerol za rast celične biomase kvasovk in glukozo za sintezo D-manoze. Razvili so metodo sinteze D-manoze, ki je primerljiva oz. boljša kot so trenutne metode [2].

Literatura

[1] H. Wu, W. Zhang, W. Mu: Recent studies on the biological production of D-mannose. Appl Microbiol Biotechnol 2019, 103, 8753–8761. DOI: 10.1007/s00253-019-10151-3

[2] S. Zhao, Y. Wang, Q. Li, J. Xie, X. Xu, W. Zhang, J. Zhang, B. Liu: Rewiring central metabolism in Komagataella phaffii for efficient mannose synthesis. Microb Cell Fact 2025, 25, 9. DOI: 10.1186/s12934-025-02886-8

[3] X. Hu, Y. Shi, P. Zhang, M. Miao, T. Zhang, B. Jiang: D‐Mannose: Properties, Production, and Applications: An Overview. Comp Rev Food Sci Food Safe 2016, 15, 773–785. DOI: 10.1111/1541-4337.12211

[4] J. S. Cho, G. B. Kim, H. Eun, C. W. Moon, S. Y. Lee: Designing Microbial Cell Factories for the Production of Chemicals. JACS Au 2022, 2, 1781–1799. DOI: 10.1021/jacsau.2c00344

[5] M. H. Hussain, M. Z. Mohsin, W. Q. Zaman, J. Yu, X. Zhao, Y. Wei, Y. Zhuang, A. Mohsin, M. Guo: Multiscale engineering of microbial cell factories: A step forward towards sustainable natural products industry. Synth Syst Biotechnol 2022, 7, 586–601. DOI: 10.1016/j.synbio.2021.12.012

[6] Y. Unver, I. Dagci: Komagataella phaffii (Pichia pastoris) as a Powerful Yeast Expression System for Biologics Production. Front Biosci (Elite Ed) 2024, 16, 19. DOI: 10.31083/j.fbe1602019

[7] M. L. Leite, K. B. S. de Oliveira, L. F. Lima, N. T. M. Melo, J. Brango-Vanegas, H. C. Paes, O. L. Franco: Komagataella phaffiias a microbial cell factory for antimicrobial peptide production. Journal of Biotechnology 2025, 408, 275–287. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.09.015

​