Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.7b00397
UVOD
V reke in morja se vsako leto sprosti ogromne količine krem za zaščito pred soncem. Sestavine v umetnih sončnih kremah močno vplivajo na okolje, saj se akumulirajo v živalih in vplivajo na fitoplankton, kar vpliva na strukturo vodne biote. Sončne kreme vsebujejo različne vrste sintetičnih organskih in anorganskih spojin, ki povzročajo porast populacije dinoflagelatov in nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti. Rešitev tega problema je uporaba naravnih sončnih krem, saj so okolju prijazne. Ena izmed glavnih sestavin je šinorin. Trenutno pa sta na trgu dva proizvoda s to spojino in sicer Helioguard 365 in Helionori. [1,2]
MIKOSPORINU PODOBNE AMINOKISLINE
Mikosporinom podobne aminokisline so majhni sekundarni presnovki, ki jih proizvajajo organizmi, ki živijo v okolju z veliko količino sončne svetlobe, običajno morskem. Trenutno je odkritih približno 30. Nahajajo se v številnih mikroorganizmih, vključno z heterotrofnimi bakterijami, cianobakterijami, mikroalgami, askomicetami in baziidiocemičnimi glivami ter nekaterimi večceličnimi organizmi, kot so makroalge in morske živali. So precej majhne molekule, velike približno 400 Da. Vsebujejo 4-deoksigadusolno jedro (4-DG). MAA hitro pretvorijo absorbirano energijo v toploto, ne da bi pri tem nastale proste kisikove zvrsti. Vse MAA absorbirajo ultravijolične žarke, valovne dolžine med 310 in 362 nm. Spadajo med najmočnejše naravne absorbatorje ultravijoličnega sevanja. Poleg tega, da celice ščitijo pred mutacijo z UV sevanjem in prostimi radikali, MAA lahko povečajo celično toleranco do izsušitve, solnega in vročinskega stresa. Pri sintezi je 4-DG prvi ključni intermediat, ki ga pridobimo po šikimatski poti. Nato z ATP-ligazo na C3 4-DG dodamo glicin, da pridobimo mikosporin-glicin (MG) iz katerega nato nastanejo MMA z neribosomsko peptidno sintetazo (NRPS). Alternativna pot sinteze je bila pred kratkim odkrita v cianobakterijah, kjer 4-DG lahko prizvedemo iz sedoheptoze-7-fosfata in pentoznega fosfata. [1,3]
Šinorin spada med MMA in ga proizvajajo večinoma morske cianobakterije in alge. Komercialno uporabljen šinorin je izoliran iz rdeče alge Porphyra umbilicalis z izkoristkom 3,27 mg/g suhe biomase. P. umbilicalis se pogosto pridobiva iz narave, vsebnost MAA pa se lahko sezonsko in geografsko razlikuje. Gojenje vrste P. umbilicalis je problematično zaradi dolgega časa rasti, saj tudi v optimiziranih laboratorijskih pogojih raste od 2 do 6 dni, v naravi pa najmanj 64 dni. Heterološka ekspresija je koristna strategija za proizvodno naravnih proizvodov različnega izvora. Pri proizvodni šinorina v gostitelji E. coli pride do zelo malo proizvedene spojine in sicer 145 µg/L, poleg tega pa se znatno kopiči 4-GD, kar kaže na neučinkovito in neuravnoteženo proizvodnjo. Razlog za neuspešnost E. coli kot gostitelja je verjetno izrazito različnimi genetskimi ozadji med cianobakterijami in E. coli, npr. vsebnost genskega GC, promotorji, struktura polimeraze RNA in σ faktorjev. Enocelična cianobakterija Synechocystis sp. PCC6803 je pogost gostitelj za raziskave cianobakterij in se uporablja za proizvodnjo biogoriv, osnovnih kemikalij in biomaterialov. Primerna je predvsem zaradi kratkega časa podvojitve, ki je 5 do 10 ur, v primerjavi z ostalimi cianobakterijami, pa se lahko prilagodi genskim razlikam in ne vsebuje NRPS klastrov, s čimer se izognemo sintezi konkurenčnih biosintetskih gradnikov in poenostavimo izolacijo in identifikacijo izraženih produktov. [1]
HETEROLOŠKA PRODUKCIJA ŠINORINA V SYNECHOCYSTIS
Genske klastre šinorina so pridobili iz cianobakterije Fischerelle, saj je od vseh potencialnih cianobakterij proizvedla največ šinorina. Vendar pa je proizvodna šinorina iz rdečih alg še vedno štirikrat višja. Za hiter dostop do šinorina so poskušali heterologno izraziti genski klaster iz vrste Fischerella v Synechocystis. Končni korak biosinteze šinorina katalizira encim NRPS. Le-ta za aktivnost potrebuje posttranslacijske modifikacije. Da bi zagotovili uspešno proizvodnjo šinorina, so koekspresirali gen fosfopantetenil transferaze (PPT) in genski klaster šinorina, vključno z nativnim promotorjem, z uporabo samoreplikativnega vektorja pRL1383a. Izražanje PPT je bilo pod nadzorom PrnpB, močnega konstitutivnega promotorja Synechocystis. Dobljeni konstrukt so konjugirli v triparentalnem parjenju Synechocystisvia, da so ustvarili proizvodni sev Sh-Pori. S PCR so potrdili prisotnost genskega klastre šinorina v celicah Sh-Pori in opazili pravilno transkripcijo vseh genov z uporabo RT-PCR. Nato so gojili Sh-Pori skupaj z dvema kontroloma 'wild type' (WT) Synechocystis in inženirskim sevom. Preko HPLC analize so določili spojino, ki je v kontrolah niso zaznali. Spojino so identificirali kot šinorin, z primerjavo retenznega časa in MS analize. Synechocystis je dosegla popolno pretvorbo vseh biosintetskih intermediatov in je tako primeren gostitelj šinorina. [1]
IZBOLJŠANJE PROIZVODNE ŠINORINA Z UPORABO RAZLIČNIH PROMOTORJEV
Transkripcijski elementi nadzirajo produktivnost izraženih spojin v Synechocystis, vendar se njihove funkcije razlikujejo med različnimi gostitelji cianobakterij. Za namen komercialne proizvodne šinorina so optimizirali izražanje šinorinskega klastra s pomočjo treh promotorjev z različno jakostjo, in sicer z sintetičnim promotorjem Ptrc in dvema promotorjema Synechocystis PrnpB in Pcpc560. Tako so ustvarili tri nove ekspresijske vektorje in jih vstavili v Synechocystis, ter pridobili proizvodne seve Sh-Ptrc, Sh-PrnpB in Sh-P560. Preučili so proizvodno šinorina pri uporabi vsakega seva posebej. Sh-PrnpB je proizvedel najmanj šinorina, Sh-P560 pa največ. Vsi ti sevi so proizvedli za približno 4, 5 in 8-krat več šinorina v primerjavi s Sh-Pori. Prav tako sta Sh-Ptrc in Sh-P560 proizvedla več šinorina kot katera koli znana cianobakterijska vrsta. Poleg šinorina so ti sevi ustvarili tudi stransko spojino, ki so jo s pomočjo analize MS in maksimalne absorbcije identificirali kot 4-DG. Proizvodna 4-DG kaže na neuravnoteženo izražanje biosintetskih genov. S pomočjo RT-PCR analize so določili stopnjo transkripcije FsA v Sh-Pori približno 2, 3 in 3-krat višjo od FsB, FsC in FsD. V primerjavi z originalnim promotorjem so Ptrc, PrnpB in Pcpc560 povečala raven transkripcije FsA in FsB za približno 10, 5 in 19 krat, kar je v skladu z izboljšano proizvodnjo šinorina v treh novih sevih. Kopičenje 4-DG je bilo verjetno posledica relativno nizkega izražanja FsC, katerega kodirani encim pretvori 4-DG v MG. Stopnja transkripcije FsC v Sh-P560 je bila za 2–4 krat višja od Sh-Ptrc in Sh-PrnpB, kar je verjetno povzročilo nastanek 1,5–2-krat več šinorina. [1]
PRILAGODLJITEV IZRAŽANJA POSAMEZNIH GENOV
Da bi dosegli popolno pretvorbo nakopičenega 4-DG, so poskušali zvišati izražanje FsC v Sh-P560. Uporabili so najmočnejši promotor Pcpc560 in ga vstavili v glavno verigo FsC gena šinorinskega klastra v Sh-P560. Kot pričakovano 4-DG po novi analizi ni bil zaznan, koncentracija šinorina pa se je povišala na 1,93 ± 0,09 mg/g DW. V HPLC analizi so zaznali novo spojino, ki so jo identificirali, po MS in absorpcijskem maksimumu, kot MG. Pcpc560 je izboljšal nivoje transkripcije FsC in FsD za 4 oziroma 8krat, v primerjavi s Sh-P560. Vendar je raven FsD ostala najnižja med vsemi geni in je bila več kot 2-krat nižja od FsC. V intergenično območje FsC in FsD so vstavili še tretji promotor Pcpc560 in ustvarili proizvodni sev Sh-TP560. Analiza qRT-PCR je pokazala 4-kratno povečanje transkripcije FsD v Sh-TP560, kar je 2-krat večja od FsC. Pri tem sevu se je stranski produkt MG v celoti pretvoril v šinorin, poleg tega pa prekomerna proizvodnja šinorina ni vplivala na rast Sh-TP560. Koncentracija šinorina se je povečala skupaj z obdobjem gojenja, kar kaže na stabilnost proizvodnje. V primerjavi z koncentracijo pridobljeno iz rdečo alge P. umbilicalis, je koncentracija umetno pridobljenega šinorina 73%. Vendar zahteva bistveno krajše obdobje rasti, kar kaže na potencial Sh-TP560 za dobavo šinorina za komercialno uporabo. [1]
VPLIV EKSOGENEGA L-SERINA IN UV ŽARKOV NA PROIZVODNO ŠINORINA
L- serin je potrebna spojina pri biosintezi šinorina, zato bi lahko povečana količina tega perkurzorja izboljšala produktivnost. V Sh-DP560 in SH-TP560 je prišlo do popolne pretvorbe DG v MG, kar pomeni, da celična razpoložljivost l-serina ne omejuje biosinteze šinorina. Vpliv l-serina so preizkusili tako, da so v medij za kulture Sh-TP560 vnesli različne koncentracije l-serina. Opazili so, da l-serin zavira rast le, ko je njegova končna koncentracija višja od 0,5 mM. Pri 0,5 mM l-serin ne vplival na rast seva in izkoristek šinorina, kar kaže, da l-serin ni omejujoč dejavnik pri proizvodnji šinorina v Sh-TP560. [1]
Primarna biološka funkcija MAAs ščiti organizme pred poškodbami UV-sevanja, zato je bila potrebna ocenitev fotoprotektivnh učinkov šinorina na rast Sh-TP560. Kolonije WT, Synechocystis-pRL1383a in Sh- TP560 so izpostavili UV-A, UV-B žarkom in beli svetlobi 5 ur dnevno 13 dni. V primerjavi z belo svetlobo so UV žarki zmanjšali rast vseh sevov, kar je bilo pričakovano, saj imajo škodljiv vpliv na žive organizme. Niti UV-A niti UV-B žarki niso imeli pomembnega vpliva na proizvodnjo šinorina v Sh-TP560. [1]
ZAKLJUČEK
V raziskavi so dokazali uspešno uporabo Synechocystis kot heterolognega gostitelja za proizvodnjo šinorina. Sh-TP560 je proizvedel 2,37 ± 0,21 mg / g DW končnega produkta šinorina, kar je primerljivo z proizvodno iz alg P. umbilicalis. Rezultati so pokazali, da je Synechocystis nov dober potencialni gostitelj za pridelavo snovi, ki jih najdemo v cianobakterijah. Poleg tega pa je proizvodna preko Synechocystis okolju prijazna in cenovno ugodna.
VIRI
[1] Guang Yang, Monica A. Cozad, Destin A. Holland, Yi Zhang, Hendrik Luesch, and Yousong Ding: Photosynthetic Production of Sunscreen Shinorine Using an Engineered Cyanobacterium; ACS Synth. Biol. 2018, 7, 664−671
[2] M.Sendra, D Sánchez-Quiles, J.Blasco, I.Moreno-Garrido, L.M.Lubián, S.Pérez-García, A.Tovar-Sáncheza: Effects of TiO2 nanoparticles and sunscreens on coastal marine microalgae: Ultraviolet radiation is key variable for toxicity assessment; Volume 98, January 2017, Pages 62-68
[3] Saurabh Bhatia, Arun Garg, K. Sharma, S. Kumar, A. Sharma, and A. P. Purohit: Mycosporine and mycosporine-like amino acids: A paramount tool against ultra violet irradiation; Pharmacogn Rev. 2011 Jul-Dec; 5(10): 138–146.
