Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi
Izvorni članek: Ellis T., Wang X. & Collins J.J. Diversity-based, model-guided construction of synthetic gene networks with predicted functions. Nat. biotechnol. 27, 465-471 (2009).<ref>Ellis T., Wang X. & Collins J.J. Diversity-based, model-guided construction of synthetic gene networks with predicted functions. Nat. biotechnol. 27, 465-471 (2009).</ref>
Uvod
Ideja sintezne biologije je aplikacija inženirskih principov na bioloških sistemih.<ref>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D.K. & Weiss, R. Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline. Mol. Syst. Biol. 2, 2006–0028 (2006).</ref> Želja pa, da s podatkovnimi bazami dobro okarakteriziranih standardnih delov in naprav omogoči sintezo sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi.<ref>Guet, C.C., Elowitz, M.B., Hsing, W. & Leibler, S. Combinatorial synthesis of genetic networks. Science 296, 1466–1470 (2002).</ref> Kljub velikemu zanimanju za področje in vse večje baze "okarakteriziranih standardnih delov", so takšne sinteze precej težavne in zamudne.<ref name="Marguet">Marguet, P., Balagadde, F., Tan, C. & You, L. Biology by design: reduction and synthesis of cellular components and behaviour. J. R. Soc. Interface 4, 607–623 (2007).</ref> Predvsem zaradi slabe karakterizacije delov (npr. veliko promotorjev je opisanih le z močen ali švoh).
Dodaten problem zaradi pomanjkanja standardnih delov, je nezmožnost spremembe dinamičnega območja nekega dela, da bi delal z drugimi komponentami, ne da bi za to bilo potrebno ponovno načrtovanje celotnega sistema. Na primer; promotor Lac je po testiranju prešibek, tako ga je potrebno zamenjati. Zaradi pomanjkanja negativno regulatornih promotorjev, bomo tega zamenjali najverjetneje s promotorjem Tet. Nat. biotechnol. 27, 450 (2009) figure 1 shema prikazuje sistem, ki posreduje informacije iz »upstream« vezja do »downstream« vezja. (a) Zamenjava PLac z PTet zahteva zamenjavo posredniškega gena in potrebno ponovno načrtovanje celotnega sistema, saj imata TetR in tTA enako vezavno domeno in bi interagirala en z drugim. (b) Zamenjava prešibkega promotorja z močnejšim ne zahteva ponovnega načrtovanja in pokaže kako se bi temu lahko izognili, če bi imeli promotorje Lac z različno transkripcijsko aktivnostjo.<ref name="News">Bennett, M.R. & Hasty J. Overpowering the component problem Nat. biotechnol. 27, 450-451 (2009).</ref>
Današnji pristopi v sintezni biologiji temeljijo na sestavljanju majhnega števila različnih bioloških delov ter in vitro testiranja, praviloma brez predhodnega in silico modela.<ref>Yokobayashi, Y., Weiss, R. & Arnold, F.H. Directed evolution of a genetic circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16587–16591 (2002).</ref> Slednji se uporabljajo predvsem za interpretacijo rezultatov in ne kot vodilo za sestavljanje sistemov. Prav zato večina projektov uspe šele po mesecih iterativnega retrofitanja, ponavadi z mutagenezo nepopolnih delov ali zamenjavo dela.<ref name="Marguet" /> Za napredek vede je ključno identificirat metode za boljše predvidevanje lastnosti genskih vezij in zmanjšati čas dela v laboratoriju.
Ellis in sod. problem komponent rešijo z ustaljenimi eksperimentalnimi tehnikami. Najprej so pripravili knjižnico promotorjev Lac in Tet z naključnimi neesencialnimi zaporedji in jim izmerili transkripcijske aktivnosti. Tako pripravljeni promotorji zaradi različnih transkripcijskih lastnosti že rešijo problem prikazan na Nat. biotechnol. 27, 450 (2009) figure 1. Rezultate so pofitali v računski model, na podlagi katerega so lahko dovolj dobro predvideli kvantitativne lastnosti promotorjev v genskih vezjih. Ellis in sod. so nadaljevali in promotorje iz knjižnice uporabili v negativni zanki s predvidevanjem (ang. negative feedforward loop) in korepresivno preklopno stikalo (ang. co-represive toggle switch). V obeh vezjih so z računskim modelom dovolj dobro predvideli obnašanje vezja za nek promotor iz knjižnice. Na koncu so prikazali s sedimentacijo kvasovk kako bi takšne naprave lahko uporabili v obstoječih procesih (npr. pri varjenju piva, kjer je kvasovke potrebno ostraniti).
Ker je sinteza promotorjev relativno hitra v primerjavi s ponovnim načrtovanjem vezja, nam takšni računski modeli z izjemno napovedno močjo lahko zelo znižajo ceno in skrajšajo čas sintezno bioloških projektov.
Sinteza in karakterizacija knjižnic promotorjev
Knjižnico regulativnih promotorjev Tet so pripravili, kot prikazuje Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 1a, s prileganjem poceni enoverižnih DNA, ter sintezo dvoverižne DNA s Klenowim fragmentom DNA polimeraze. Stalna zaporedja, ki so jih uporabili (TATA škatla, 2x Tet operon, mesto za začetek promotorja GAL1 in restrikcijski mesti PstI ter BamHI) dajejo regulativnemu promotorju funkcijo, naključne pa vplivajo na moč izražanja, najverjetneje zaradi spremembe v lokalni konformaciji DNA.<ref>Entus, R., Aufderheide, B., Herbert, M. & Sauro, M.H. Design and implementation of three incoherent feed-forward motif based biological concentration sensors. Syst. Synth. Biol. 1, 119–128 (2007).</ref>
Po sintezi, so promotorje ligirali v vektor pred genom za yEGFP kot prikazuje Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 1b, kateri pod močnim konstitutivnim promotorjem TEF1 izraža represor promotorja Tet (TetR). To ima za posedico nizko bazalno izražanje yEGFP, večje izražanje pa omogoča dodatek ATc – inhibitorja TetR. S tako pripravljenimi vektorji so transformirali kvasovke. Posamezne kolonije so kasneje na plošči v gojišču z 2% galaktoze z in brez dodatka 250 ng/mL ATc-ja testirali za aktivnost s pretočno citometrijo. Brez dodatka so določili parameter ekspresije Smin, z dodatkom pa Smax. Glede na rezultate so izbrali 20 promotorjev, ki pokrivajo širok spekter ekspresije in inhibicije, kot prikazuje Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 1c-e.
Na enak način so pripravili tudi knjižnico 20ih promotorjev Lac, pri katerem je namesto prvega operona Tet operon Lac, za določanje parametrov ekspresije pa so uporabili IPTG. Taki promotorji se bodo torej odzvali na represorje operona Tet, kot tudi represorje operona Lac, tako bodo delovali kot logična vrata ali.
Inkoherentna zanka s predvidevanjem tipa II
Da bi pokazali, kako je njihov pristop možno uporabiti v genskem vezju, so uporabili in silico model za proučevanje inkoherentne zanke s predvidevanjem tipa II. Pri takšni je izhodni gen reguliran z dvema drugima represorskima genoma, od katerih je en reguliran z drugim Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 2a.<ref>Mangan, S. & Alon, U. Structure and function of the feed-forward loop network motif. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 11980–11985 (2003).</ref>
Pred in vitro poizkusi so uporabili podatke (Smin in Smax) dobljene iz karakterizacije knjižnice promotorjev Tet, ki je predvidel odziv (ekspresijo yEGFP) v odvisnosti od koncentracij ATc-ja in IPTG-ja. Model je služil kot vodilo, katere promotorje iz knjižnice ter kakšne koncentracije ATc-ja in IPTG-ja izbrati, da bodo pridobljeni podatki kar se da informativni. Simulacije so prikazane na Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 2b. Simulacija za kontrolni promoter TX oz. GAL1 pokaže vrh pri srednjih koncentracijah ATc-ja in visokih IPTGja. Povečevanje vrednosti Smin (menjava TX za T8) praktično prepreči ekspresijo v nizkih koncentracijah IPTG-ja, znižanje Smax (menjava TX za T18) pa vrh ekspresije premakne k višjim koncentracijam ATc-ja; glej Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) table 1 in Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 2b. Eksperimentalno pridobljeni podatki na Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 2c se skladajo z izračunanimi.
To kaže, kako lahko kvantitativno enak vhodni signal (ATc ali IPTG) povzroči zelo drugačen odziv sistema, le zaradi majhne spremembe v promotorju. Na tak način so Ellis in sod. naslovili problem dinamičnega območja.
Predvidljivi genetski odštevalnik na podlagi ko-represivnega preklopnega stikala
V nadaljevanju, so naredili bolj kompleksno ko-represivno vezje z dvema knjižnicama promotorjev prikazano na Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 3a. Tak odštevalnik se vključi z odstranitvijo ATc. Začetni računski model, ki so ga pripravili je pokazal, da na čas, po katerem se bo odštevalnik ponastavil, vpliva razmerje ekspresije promotorjev. Zaradi kompleksnosti sistema, pa model na podlagi podatkov o promotorjih ni uspel dovolj zanesljivo predvideti kakšen bo ta čas. Začasna dinamika takšnega sistema namreč ne more biti predvidena. Vezje s promotorjema TX-LX so stestirali in vitro in podatke uporabili za kalibracijo modela, ki je potem uspel kvantitativno zadovoljivo predvideti obnašanje odštevalnikov.
Model so tako uporabili kot vodilo, kako se bo spreminjal čas, po katerem se bo odštevalnik ponastavil v odvisnosti od izbire promotorja. Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 3b-f pokaže, da se eksperimentalno določeni podatki in tisti dobljeni iz in silico modela skladajo. Na Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 3g pa lahko vidim, da odziv vezja korelira z razmerjem Smax-Smin.
Časovno nadzorovana sedimentacija kvasovk
Da so članek objavili v reviji nature pa so za konec prikazali še uporabo s fenotipom, ki je ključen v industriji piva, vina in bio-etanola. Pri teh je namreč sedimentirane kvasovke potrebno odstraniti po vrenju.<ref>Verstrepen, K.J. & Klis, F.M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol. Microbiol. 60, 5–15 (2006).</ref> Najprej so eksperimentalno določili kdaj se sedimentacija zaradi FLO1 začne, ter upoštevali to v in silico modelu, na podlagi katerega so se odločili, katere promotorje bodo testirali in vitro. Kvasovke, ki ne izražajo FLO1 so transfecirali s tremi konstrukti, spremljali fenotip po odstranitvi ATc-ja in rezultate primerjali s predvidenimi, kot je prikazano na Nat. Biotechnol. 27, 465 (2009) figure 4.
S tem poizkusom, so pokazali kako lahko hitro pripravimo genetska vezja s predvidenimi in industrijsko želenimi funkcijami na podlagi in silico modeliranja.
Viri
<references/>
