Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

Mucuna bracteata

Mucuna bracteata je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja M. bracteata zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

Protitelesa proti Toxoplasma gondii

Raziskovalci so v M. bracteati pripravili himerna protitelesa proti parazitu Toxoplasma gondii. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov scFv. Variabilni domeni iz fragmentov scFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

Potek eksperimenta

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo Agrobacterium tumefaciens. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno transformacijo, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4]. A. tumefaciens so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z A. tumefaciens, nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker M. bracteata vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti T. gondii so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene T. gondii pa so določili z metodo ELISA [2].

Rezultati

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo A. tumefaciens [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno transformacijo v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v M. bracteata so primerjali tudi s tobakom (Nicotiana benthamiana). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom M. bracteata proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z N. benthamiana (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri M. bracteata prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz M. bracteata podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z N. benthamiana [2].

Zaključki

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline M. bracteata kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodna transformacija z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku [2].

Viri

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. Planter 1998, 74(860), str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. Mol. Biotechnol. 2020, 62(4), str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. PeerJ 2018, 2018(12).

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. Biotechnology Advances. Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.