Razvoj gostiteljskega organizma Pseudomonas asiatica za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola

Uvod

3-hidroksipropionska kislina (3-HP) je zelo uporabna C3 spojina. Lahko jo pretvorimo v mnoge druge C3 spojine (akrilna kislina, akrilamid, propiolakton…), ima pa tudi široko uporabnost v barvni in polimerni industriji ter industriji plenic.

Za učinkovito biološko proizvodnjo 3-HP iz glicerola potrebujemo tri encime. Prvi je glicerol dehidrataza (GDHt), ki katalizira dehidracijo glicerola v 3-hidroksipropionaldehid (3-HPA), za delovanje pa potrebuje koencim B₁₂. Drugi je aldehid dehidrogenaza (ALDH), ki nato oksidira 3-HPA do 3-HP. Tretji je glicerol dehidrataza reaktivaza (GdrAB), ki uporabljeni koencim B₁₂ v GDHt nadomesti z novim. Za proizvodnjo 3-HP iz glicerola je že bilo razvitih nekaj bakterijskih sevov (E. coli, K. pneumoniae, P. denitrificans), vendar imajo vsi svoje pomanjkljivosti.

V raziskavi, ki je predstavljena v izhodiščnem članku, so se osredotočili na razvoj nove gostiteljske vrste, ki proizvaja 3-HP iz glicerola, kot vir ogljika pa uporablja glukozo. Izolirali so sev Pseudomonas asiatica C1 in sekvencirali njegov celoten genom. Po vzpostavitvi 3-HP sintezne poti, so modificirali (inhibirali) pot degradacije 3-HP, metabolizem glicerola in pot sinteze 1,3-propandiola. Tako so razvili sev, ki učinkovito proizvaja 3-HP iz glicerola z minimalnim dodatkom koencima B₁₂.

Izvedba eksperimenta

Uporabljen bakterijski sev so izolirali iz aktivnega blata iz čistilne naprave v Koreji. Po sekvenciranju genoma so sev identificirali kot vrsto Pseudomonas asiatica, ki je gramnegativna, aerobna, paličasta, nesporulirajoča bakterijska vrsta. Sev so poimenovali Pseudomonas asiatica C1. Celice so gojili v modificiranem gojišču M9 pri 30°C in tako pripravili inokulume za glavni del študije. Da bi ugotovili, koliko koencima B₁₂ sintetizira P. asiatica C1, so bakterije v eksponentni fazi razbili s sonifikacijo in celični lizat uporabili v gojišču za gojenje reporterskega seva Salmonella typhimurium ΔmetEΔcbiB. Obseg rasti S. typhimurium je odražal količino koencima B₁₂ v celičnem lizatu. Za razvoj ustreznih plazmidov so uporabili sev E. coli Top10. Kromosomske gene so deletirali s pomočjo delecijskih plazmidov, ki so vsebovali fragmente, sestavljene iz 500 baznih parov višje in 500 baznih parov nižje od gena, ki so ga želeli izbrisati. Ko so vektor vstavili v bakterijske celice, je med plazmidom in kromosomsko DNA potekla homologna rekombinacija in prišlo je do delecije na kromosomski DNA. Na tak način so zaporedno izbrisali 11 genov (11 različnih sevov, z 1 do 11 delecijami). Zasnovali so tudi ekspresijski plazmid z zapisom za glicerol dehidratazo, glicerol dehidratazo reaktivazo in aldehid dehidrogenazo pod ustreznimi promotorji. Končni plazmid pDK, ki je vseboval vse potrebno za sintezno pot 3-HP, so nato vstavili v bakterije P. asiatica C1 in vse njene različice.

Rezultati in diskusija

Rast seva P. asiatica C1 in produkcijo koencima B₁₂ so preverjali za tri različne vire ogljika: glukozo, glukonat in glutamat. Kot referenčni sev so uporabili sev P. denitrificans ATCC 13867, saj potrjeno dobro raste na glukonatu in glutamatu. Oba seva sta dobro rasla na glukonatu in glutamatu, na glukozi pa je dobro rasel le sev P. asiatica C1, kar predstavlja prednost, saj je glukoza cenejša. Tudi v količini proizvedenega koencima B₁₂ je bil sev P. asiatica C1 v prednosti, ne glede na vir ogljika. Proizvodnja 3-HP v divjem tipu seva P. asiatica C1 (brez delecij) je bila precej slaba, donos je znašal okoli 0,37 mol/mol glicerola. Pojavil pa se je le en stranski produkt, to je 1,3-propandiol. Pokazali so, da pot sinteze 3-HP sicer dobro deluje v novem gostitelju, vendar so za boljši izkoristek potrebne modifikacije gostiteljskega seva. V naslednjih fazah eksperimenta so postopno uvajali nove delecije v gostiteljski sev P. asiatica C1. Najprej so deletirali tri gene, ki kodirajo encime, ki razgrajujejo 3-HP. Sev, ki je imel izbrisane vse tri gene, ni več razgrajeval 3-HP, donos se je povečal na 0,62 mol/mol glicerola. V naslednjem koraku so dodatno izbrisali dva gena, katerih produkta sodelujeta pri katabolni presnovi glicerola, saj je cilj, da se celoten glicerol pretvori v produkt. Donos se je povečal na 0,87 mol/mol glicerola. V zadnjem koraku so dodatno izbrisali še 5 genov za 1,3-propandiol oksidoreduktaze, ki so odgovorni za to, da namesto 3-HP nastaja stranski produkt 1,3-propandiol. V končnem rekombinantnem sevu (z vsemi 11 delecijami) je bil donos 3-HP 0,99 mol/mol glicerola, le 1% glicerola pa se je pretvoril v 1,3-PDO. Na koncu je sledila proizvodnja 3-HP v 2 litrskem bioreaktorju. Ob dodajanju koencima B₁₂ se je proizvodnja zelo povečala, največja izmerjena produktivnost je bila 2,15 g produkta/L/h izkoristek pa 98%.

Zaključek

Študija dokazuje, da je novi izolat P. asiatica C1 dober gostitelj za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola. Dobro raste na glukozi in v aerobnih pogojih rasti proizvaja koencim B₁₂, zato je zelo obetaven rekombinantni sev. Za komercialne namene pa je treba izvesti nadaljnje študije za zmanjšanje potrebe po koencimu B₁₂ in za izboljšanje titra.