Razvoj robustnega sistema genetskega biozadrževanja kvasovk s stikalom za stabilnost proteinov

Povzeto po: Engineering stringent genetic biocontainment of yeast with a protein stability switch

Uvod

Ob vse večjih možnostih manipulacije z genomom vseh vrst organizmov, in hkratnemu strmemu padcu cene za to potrebnih orodij, področje sintezne biologije ponuja odgovore na vse več problemov, s katerimi se človeštvo sooča [1]. Kot pri vseh razvijujočih se tehnologijah pa je potrebno tudi na tem podoročju poskrbeti za varnostne protokole in postopke za minimizacijo tveganja.

Eden izmed glavnih faktorjev zagotavljanja varnosti ko pride do mikroorganizmov je biozadrževanje [2]. Sprememba laboratorijskih mikroorganizmov na tak način, da v naravi niso sposobni preživetja je ključna za zmanjšanje tveganja vnosa gensko spremenjenih mikroorganizmov v naravo. To lahko dosežemo na več načinov, najpogosteje z ustvarjanjem auxotrofičnih organizmov preko izbijanja genov, potrebnih za sintezo ključnih metabolitov, ali pa s kontrolo preko samomorilskih genov. Oba pristopa imata svoje probleme, auxotrofični organizmi lahko potrebne metabolite najdejo tudi v določenih naravnih okoljih, pri samomorilskih genih pa evulucijski pritisk pogosto vodi do mutacije na teh genih in njihove posledične inaktivacije [1],[2]. Tretji pristop se osredotoči na pozitivno kontrolo esencialnih genov preko pogojevanja njihovega prepisovanja ali stabilnosti s pogoji prisotnimi le v željenih okoljih [1],[2]. Članek se osredotoči na kontrolo stabilnosti esencialnh proteinov preko uvedbe oznake destabilizacijske domene, ki pa jo stabilizira prisotnost estradiola (ERdd – angl. destabilizing domain degron stabilized by estradiol addition).

Pregledovanje knjižnice za potencialne kandidate

Raziskovalci so najprej preverili vpiv destabilizacije ERdd na GFP z gojenjem kultur kvasovk S. Cerevisiae v prisotnosti in odsotnosti estradiola. V mediju brez estradiola je bila fluorescenca manjša za 95 %, celice v mediju z dodanim estradiolom pa v primerjavi s celicami brez ERdd oznake dosežejo 70 % fluorescence [2]. To nakazuje na možnost uporabe te oznake za namen kontrole stabilnosti esencialnih proteinov.

V nadaljevanju so raziskovalci uporabljali knjižnico kvasovk s proteini, označenimi z GFP (angl. yeast GFP collection), pri katerem je v posameznem sevu po en protein označen z GFP (knjižnica vsebuje 4159 sevov), za njim pa se nahaja še selekcijski marker HIS3MX6. Na podlagi te stalne regije so s pomočjo CRISPR/Cas9 sistema na koncu zapisa za GFP dodali oznako ERdd, hkrati pa zamenjali selekcijski marker HIS3MX6 za LEU2, kar je omogočalo lažjo selekcijo celic, ki so sprejele vnos. Spremenili so 94 % sevov z označenimi proteini, ki se v S. Cerevisiae štejejo med esencialne [2].

Spremenjene seve so nanesli na plošče z in brez dodanega estradiola in identificirali tiste proteine, pri katerih je bila razlika v rasti najbolj izrazita. Za večino proteinov opazne razlike v rasti ni bilo, ta je bila opazna le v 5 % primerov. Za nadaljnje poskuse so izbrali 46 sevov, ki so jih nato gojili še v tekočih kulturah z in brez estradiola ter jim odčitavali optično gostoto. Pri večini sevov niso opazili stroge odvisnosti rasti od prisotnosti estradiola, analize fluorescence in nivoja izražanja GFP pa so potrdile, da se označeni proteini ob odsotnosti estradiola razgrajajo (47-84 % po 24 urah brez estradiola). Zaključili so, da je za večino esencialnih proteinov ostala nerazgrajena zadostna količina za rast [2].

V nadaljevanju so izbrali 6 genov (SEC18, SES1, SPC110, SEC14, RRP46 in DIS3), katerih sevi so pri prejšnjem poskusu pokazali največjo razliko v rasti, in jim v sevu BY4742 neosredno pripeli oznako ERdd, brez uporabe markerskega proteina. Vseh 6 tako nastalih sevov je bilo za rast odvisnih od estradiola. Njihovo rast v prisotnosti estradiola so primerjali še z nespremenjenm sevom BY4742, in na podlagi slabše rasti v primerjavi z njim izločili 3 seve. Če namreč kontrolni sistem povzroča slabšo rast seva od divjega tipa to ustvari evolucijski pritisk v smer inaktivacije le tega. Za nadaljnje raziskave so zato vzeli le seve, ki niso v prisotnosti estradiola kazali nobene razlike rasti v primerjavi s starševskim sevom. To so bili sevi SPC110-ERdd, RRP46-ERdd in DIS3-ERdd. Še posebej ugoden je bil sev SPC110-ERdd, ki je imel v pogojih brez estradiola močno inhibirano rast, že 100 nM koncentracija pa je zadoščala za popolno obnovitev rasti [2].

Po identifikaciji teh treh potenicalnih genov so pripravili še seve s kombinacijami dveh ERdd označenih genov. Vse kombinacije so bile strogo odvisne od prisotnosti estradiola, po njegovem odvzemu so se še nekajkrat delile, nato pa se je rast popolnoma ustavila. To sicer ni veljalo za vse seve z le enim označenim genom, saj sta seva RRP46-ERdd in DIS3-ERdd še vedno rasla v pogojih brez estradiola, četudi počasi [2].

Določevanje frekvence pobega

Da bi ugotovili, kako dobro različne kombinacije oznak ščitijo pred pobegom v okolje so vsaki varianti in njihovim kombinacijam izmerili frekvenco pobega. V ta namen so nerazredčene kulture nanesli na trdno gojišče brez estradiola (restriktivni pogoji), kulture pri redčitvi 10^-5 pa na trdno gojišče z estradiolom (permisivni pogoji) ter 10 dni spremljali število nastalih kolonij. Variante z le enim označenim genom so imele različne frekvence pobega, pri čimer je imel najnižjo frekvenco sev SPC110-ERdd (3∙10^-7), sledil mu je DIS3-ERdd (4∙10^-6), RRP46-ERdd pa na restriktivnih ploščah niti ni nehal rasti, zato je bila analiza frekvence pobeglih kolonij nemogoča. Kombinacija DIS3-ERdd in RRP46-ERdd je nekoliko izboljšala frekvenco pobega (4∙10^-6) v primerjavi s samo DIS3-ERdd, a ta razlika ni bila velika. Po drugi strani je kombinacija SPC110-ERdd s katerokoli od drugih dveh oznak frekvenco pobega znižala pod mejo detekcije poskusa, saj ni na plošči z restriktivnimi pogoji zrasla niti ena kolonija. Zato so izvedli še en poskus za detekcijo nižjih frekvenc pobega in na plošče nanesli 5∙10^9 CFU (angl. colony forming units), kar mejo detekcije izboljša na 2∙10^-10. S tem poskusom so uspeli določiti frekvenco pobega za sev SPC110-ERdd/RRP46-ERdd (1,9 ∙10^-8), sev SPC110-ERdd/DIS3-ERdd pa je bil zopet brez pobeglih kolonij in tako pod mejo detecije [2].

Vsako izmed pobeglih kolonij pri sevih z eno oznako so poslali na sekvenciranje označenega gena, pri čemer so za SPC110-ERdd ugotovili, da je za pobeg odgovorna mutacija v C-končni domeni proteina, ki povzroči spremebo bralnega okvirja in prezgodnjo uvedbo stop kodona, kar povzroči, da se ERdd oznaka ne izrazi. Ker C-končna domena proteina ni esencialna, so pripravili še konstrukt kjer so jo izpustili. Ugotovili so, da tak konstrukt ohrani lastnosti rasti v prisotnosti estradiola, njegova frekvenca pobega pa se spusti na 8,4 ∙10^-9. Prav tako so pripravili seve, kjer je bila oznaka pripeta na N-konec proteina, kar je vodilo v manjšo frekvenco mutacij, a je imelo negativen vpliv na rast celic po permisivnimi pogoji, do česar je najverjetneje prišlo zaradi napak pri lokalizaciji proteina, ki jih lahko povzročijo N-končne oznake [2],[3].

Mutacije v preiskovanih genih za seve RRP46-ERdd, DIS3-ERdd in RRP46-ERdd/DIS3-ERdd v pobeglih kolonijah niso bile prisotne, sekvenciranje celotnega genoma pa je pokazalo na prisotnost mutacij v genih, ki so vpleteni v regulacijo proteasomov, ali pa vzroka ni bilo mogoče odkriti [1].

Hitrost rasti so s starševskim sevom primerjali še na dolgi rok, pod različnimi laboratorijskimi pogoji preko 100 generacij, a niso opazili nobene razlike. To pomeni, da kuture teh sevov ne bi smele čutiti evolucijskega pritiska k utišanju kontrolnega sistema, kar so potrdili še s preverjanjem frekvenc pobega po 100 generacijah, ki je ostala enaka [1].

Zaključek

V prihodnosti lahko pričakujemo vse večjo uporabo sintezne biologije tudi v okoljih, kjer popolna fizična ločitev od zunanjosti ni mogoča. Da se tveganje za pobeg genetsko spremenjenih mikroorganizmov v naravo kar najbolj zmanjša so potrebne nove metode biozadrževanja. Trenutni standardi predlagajo frekvenco pobega, manjšo od 10^-8, kar pa je še vedno previsoko, saj je lahko takšno število celic prisotno tudi v manj kot mililitru goste kulture [2],[4]. V prihodnosti se bomo verjetno posluževali kombinacije pristopov, eden izmed katerih bo lahko tudi v članku opisan sistem destabiizacije esencialnih proteinov. Že v članku podani rezultati za več kot 100-krat presežejo zastavljene smernice, kar dosežejo z relativno poceni sistemom, saj je cena za obelavo 1000 litrov kulture z estradiolom zelo nizka, giblje se okoli enega evra [2]. Kombinacije z drugimi sistemi regulacije na podlagi estradiola bi lahko tako bile še posebej učinkovite in ugodne.

Literatura

[1] S. A. Hoffmann, J. Diggans, D. Densmore, J. Dai, T. Knight, E. Leproust, J. D. Boeke, N. Wheeler, Y. Cai: Safety by design: Biosafety and biosecurity in the age of synthetic genomics. iScience 2023, 26, 106165.

[2] S. A. Hoffmann, Y. Cai: Engineering stringent genetic biocontainment of yeast with a protein stability switch. Nature Communications 2024 15:1 2024, 15, 1–11.

[3] E. Palmer, T. Freeman: Investigation Into the use of C- and N-terminal GFP Fusion Proteins for Subcellular Localization Studies Using Reverse Transfection Microarrays. Int J Genomics 2004, 5, 342–353.

[4] R. R. Gallagher, J. R. Patel, A. L. Interiano, A. J. Rovner, F. J. Isaacs: Multilayered genetic safeguards limit growth of microorganisms to defined environments. Nucleic Acids Res 2015, 43, 1945.