Rebolutionaries

Rebolutionaries je iGEM projekt ekipe iz Univerze v Sydneyju, ki je leta 2024 zasedel 3. mesto.

Uvod

Znotrajcelična dostava zdravil je popularen, a precej omejen in oviran koncept zdravljenja. Eden glavnih virov neučinkovitosti je internalizacija molekul zdravila preko fagocitoze in neuspešna translokacije le-teh preko celičnih membran. Molekule se ujamejo v endosomalne vezikle, v katerih nimajo učinka in se nato velikokrat ali razgradijo v lizosomu ali pa izločijo iz celice. Izziv endosomalnega pobega je tako izziv v izboljšavi pobega zdravila in v premagovanju celične odpornosti. S projektom Rebolutionaries je ekipa želela razviti modularni sistem »dizajnerskih« R-telesc, ki bi lahko prenašala specifična zdravula v specifične celične tipe.

R-telesca

Refraktilna telesca ali R-telesca so ogromni, stabilni polimerni proteini, ki se v kislem endosomalnem okolju raztegnejo kot igle. To raztezanje je hitro, reverzibilno, robustno in ga je mogoče prilagajati z usmerjeno evolucijo. R-telesca so naravni sistem za dovajanje toksinov, ki je bil odkrit pri »ubijalskih« sevih paramecija (Paramecia aurelia). Ti so prek izločanja toksičnih kapa delcev povzročili smrt drugih »občutljivih« sevov paramecija. Toksični delic so bakterijski endosimbionti Caedibacter spp., v katerih najedmo R-telesca, ki omogočajo izločanje toksinov iz njih. Po elektronskim mikroskopom izgledajo R-telesca kot proteinski trakovi, ki so znotraj bakterije v zviti konformaciji. Zvito telo je strukturirano kot votel valj s plastmi, ki se lahko odvije na teleskopski način kot odziv na različne signale. Z odvijanjem se dolžina telesca poveča za več kot 20x, tudi do 20 μm, in pretrga bakterijsko steno in fagolizosom paramecija. Sama R-telesca niso toksična. Prednost uporabe R-telesc kot proteinskih nosilcev se nahaja v prečkanju bioloških pregrad, v dobri biokompatibilnosti, biorazgradljivosti, okoljski trajnosti in razpoložljivosti. Proteinske polimere lahko tudi enostavno modificiramo in jim s tem spremenimo fizikalno-kemijske lastnosti. R-telesca sestavljata dva monomera, RebA in RebB, ki sta razporejena vzporedno v tankem, ploščatem traku. Na eno stran traka so obrnjeni C-konci obeh monomerov, na drugo stran pa N-konci. Ko je trak zvit, C-konci gledajo proti notranjosti, medtem ko so N-konci obrnjeni proti zunanjemu okolju. Za konjugacijo tovorov na ogrodje R-telesc so tako na voljo štiri možna mesta: C-konec RebA, C-konec RebB, N-konec RebA in N-konec RebB.

Izražanje in čiščenje R-telesc

Ekipa je imela na razpolago dve zalogi E. coli sevov DH5α, ki sta vsebovali plazmide z Reb konstrukti, in sicer Reb1 ter njegovo fluorescenčno različico Reb206. Reb1 vsebuje operon divjega tipa R-teles, ki vključuje gene RebA, RebB, RebC in RebD. Gena RebA in RebB kodirata monomera, RebC se vgrajuje v telesa z nizko pogostostjo, funkcija gena RebD pa ni znana. Konstrukt Reb206 vsebuje fuzijski protein mNeonGreen-RebB pod nadzorom šibkega RBS-ja ter mCherry pod nadzorom močnega RBS-ja, kar omogoča potrditev izražanja proteina. S pomočjo standardnih protokolov so konstrukte amplificirali v DH5α in jih nato prenesli v sev BL21 (DE3), ki je primeren za izražanje rekombinantnih proteinov. Soočali so se s problemom, da trenutno ni zanesljivih kvantitativnih metod za merjenje koncentracije R-teles. S pomočjo fluorescenčnih tehnik so ocenili izražanje Reb206, kjer je Reb1 služil kot kontrola in na podlagi rezultatov optimizirali pogoje izražanja za divji tip. Izražanje so opravljali pri temperaturi 37 °C in v LB mediju. Sestavljanje R-telesc je energijsko zahteven proces, uporaba obogatenega medija je več kot podvojila izplen. Po optimizaciji pogojev izražanja so želeli protein očististi in potrditi aktivnost razteganja. Čiščenje se je izkazalo za precej zahtevno, saj R-telesca niso primerna za kromatografske tehnike zaradi slabe topnosti v vodnih medijih in velikosti. Poskusili so opraviti čiščenje z že znanim protokolom, ki je precej agresiven, preko liziranja celic, encimske obdelave, centrifugiranja in večkratnega pranja z detergenti. Protokola niso uspešno ponovili, namesto fine, bele usedline so pridobili nitasto, viskozno maso, kar je nakazovalno na kontaminacijo z DNA. Mikroskopski posnetki pri pH 7,5 so pokazali amorfne heterogene grudice, ko so vzorec suspendirali pri pH 5, so opazili le kratkotrajno napihovanje grud. Ključne korake čiščenja R-teles so tako morali optimizirati, več mesecev so kombinirali daljše inkubacije, večkratne encimske obedlave, različne detergente, hitrosti centrifugiranja itd. Na koncu so dosegli visoko čistost, pri kislem pH raztegovanja Reb206 niso opazili, ko pa so postopek ponovili z divjim tipom Reb1, pa so pridobili pozitivne rezultate.

Genetska sestava in konjugacija

Cilj je bil oblikovanje R-teles s funkcijo prenašanja tovora. Za njegov doseg so morali oblikovati več novih konstruktov, ki so omogočali konjugacijo tovora. Oblikovali so jih s pomočjo PCR s podaljšanim prekrivanjem (angl. overlap extension PCR) in metodo Gibsonove sestave. Izbrali so si 4 ortogonalne konjugacijske strategije: encimsko ligacijo s sortazo A, vključevanje nekanoničnih aminokislin t utišanjem amber kodona, tiol-maleimid konjugacijo in selektivno modifikacijo N-konca z 2-piridinkarboksialdehidom. Encimska ligacija s sortazo A izrablja specifičen encim, ki katalizira transpeptidazno rekacijo med C-končnim motivom LPXTG in N-končnim (Gly)n. Pri delu so konjugacijo terapevtikov omejili na C-konec proteina, želeli pa so vezati tudi fluorescenčni tovor mNeonGreen za validacijo. Ustvarili in izrazili so tri konstrukte – mNeonGreen z N-končnim oligoglicinom (GGG-mNeonGreen), ter Reb1, kjer imata RebA ali RebB na C-koncu motiv LPETG (RebA-LPETG, RebB-LPETG). Uporabili so komercialno dostopno encimsko različico sortaze (eSrtA), ki prepozna motiv LPETG. Izražanje konstruktov in encima je potekalo v sevu BL21. Pridobili so pozitivne rezultate, modifikacija R-teles ni vplivala na njihovo aktivnost raztegovanja. Amber kodonsko utišanje je tehnika razširitve genetskega koda, ki omogoča vnost nekanonične aminokisline (ncAA) s specifičnimi reaktivnimi skupinami v proteine. ncAA je dodana gojišču, prepozna jo ortogonalna aminoacil-tRNA sintentaza in je vezana na ortogonalno tRNA, ki prepozna amber kodon. Tega so vgradili na N-konec obeh monomerov, tako so ustvarili dva konstrukta (TAG-RebA in TAG-RebB). Izbrali so si aminokislino 4-azido-L-fenilalanin (AzF), ki je združljiva z reakcijo azidno-alikilinsko cikloadicije (CuAAC). Celice BL21 so tako sočasno transformirali z enim izmed konstruktov in s platmidom pEVOL AzF ter jih gojili v mediju z dodatkom AzF. Prečiščena R-telesa so nato konjugirali z barvilom sulfo-Cy5, vendar prvotna CuAAC konjugacija barvila ni bila uspešna. Reakcijo so optimizirali z dodatko liganda THPTA, ki koordinira Cu(I), preprečuje njegovo oksidacijo v Cu(II) in s tem pospeši reakcijo. Pridobili so opazne pelete, kar je nakazovalo na uspešno amber kodonsko utišanje. Opravili so tudi modifikacijo z 5-etinilpikolinaldehidom, kjer kondenzacijska reakcija poteka specifično na N-koncu peptidov. Izbran derivat 2-piridinkarboksialdehida je omogočal CuAAC označevanje in uporabo barvila sulfo-Cy5. Reakcijo so opravljali pri višji temperaturi in pridobili pozitivne rezultate. Konjugacija tiol-maleimid vključuje adicijo tiolata na dvojno vez maleimida in nastanek tiosukcinimida oz. sukcinimidil tioesterske vezi. Ker sama monomera RebA in RebB ne vključujeta cisteinskih ostankov, so pripravili konstrukte, kjer so jih dodali ali na N- ali na C-konec preko GGGS linkerja. Zaradi težav pri transformaciji celic so delo nadaljevali le z Cys-N-RebB in Cys-C-RebB. Rekacija s sulfo-Cy5 maleimidom je bila uspešna le na Cys-N-RebB, vzorka za neuspeh pri Cys-C-RebB niso odkrili. Pri preverjanju aktivnosti raztezanja so opazili, da se Cys-C-Reb zlahka raztegne v kislem, Cys-N-RebB pa se ne. Zaradi pojava nenavadni peletov so sklepali, da je to posledica nepravilnega čiščenja.

In vitro uporaba

Želeli so ovrednotiti nagnjenost celic k endocitozi R-teles in učinkovitost razpada ter sproščanja zdravil prek R-telescc. Za oceno učinkovitosti endocitoze so razvili konstrukte RebA-LPETGGG-mNeonGreen in RebB-LPETGGG-mNeonGreen. mNeonGreen ohranja svojo fluorescenco tudi v kislem okolju endosomov in je na R-telo pritrjen preko nerazcepnega povezovalca. Za sproščanje zdravila iz sistema R-teles pa so potrebni razcepni povezovalci, tovor mora biti sproščen pred raztezanjem teles. Razmišljali so o dveh pristopih, in sicer skupinah, ki so občutljive na kisline in zaporedjih, ki so občutljiva na proteaze. Za dokaz koncepta so sistem karakterizirali z aldoksorubicinom, ki ima kislinam občutljivo hidrazonsko skupino in maleimidno funkcionaliziran povezovalec. Ker so prepozno ugotovili, da se Cys-N-RebB pri nizkem pH ne raztegne, so dobljeni rezultati dokazali le vstop aldoksorubicina v endosom, ne pa tudi njegovega sproščanja. Za celično kulturo so uporabili suspenzijsko linijo EXPI293, ki izhaja iz neoplastične človeške embrionalne ledvične celične linije. Pri ocenjevanju učinkovitosti endocitoze so izračunali povprečno število teles RebA-LPETGGG-mNeonGreen na celico pri različnih razredčitvah in časih inkubacije. Povprečno število R-teles je naraščalo sorazmerno z razredčitvenim faktorjem in je v povprečju znašalo 4 telesa na celico. Število R-teles na celico je sledilo bimodalni porazdelitvi, pri visoki koncentraciji je večina celic internalizirala 5-10 teles, preostali delež pa 0-1. Vzrok in terapevtski pomen te heterogenosti zahtevata nadaljnje raziskave. Pomembno je, da konstukti niso izkazovali citotoksičnih učinkov, celice so se še naprej delile, izgledale so morfrološko zdrave.

Zaključek

Ekipa je tako skoraj pripeljala nov inovativen sistem za dostavo v celico do eksperimentalne zaključne faze. Razvili so novo metodo čiščenja, ki izkorišča naravno stabilnost R-teles in je tako primerna za katerikoli R-telesni konstrukt. Ustvarili so več novih delov (osnovnih ali sestavljenih), ki so modularni, ortogonalni in jih je mogoče enostavno prilagajati dostavnemu sistemu. Pokazali, da je produkt necitotoksičen in se učinkovito internalizira v celice. Ostal jim je le korak dokazanja, da sistem omogoča prehod membransko neprepustnih molekul v citoplazmo. Njihova ideja predstavlja obetavno rešitev za problem endosomske ujetosti, ki že od samega začetka ovira področje terapevtikov.

Viri

Revolutionising Therapeutic Delivery Systems | Sydney-Australia - iGEM 2024. Dostopno na: https://2024.igem.wiki/sydney-australia/index.html (18. 5. 2025)