Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo
Uvod
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.
Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja. Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v drugem članku pred tem. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.
Tehnologija enGenes-X-press
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG. S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo. Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor. Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor. Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.
Karakterizacija
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast. Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom. S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG. Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo. Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.
Zaključek
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.
- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.
- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov
Viri
[1.] Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7
[2.] Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348
[3.] Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1
[4.] Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25. Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912
[5.] Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.
