Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso

Izhodiščni članek: Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch

Uvod

Bakterije imajo za regulacijo izražanja genov razvite zelo natančne regulatorne mehanizme, ki se odzivajo na okoljske dejavnike, s čimer vplivajo na metabolizem glede na njihove potrebe in stadij rasti. Sintezni biologi so razvili mnogo strategij regulacije izražanja genov, predvsem na nivoju transkripcije (inducibilni promotorji, odvisni od IPTG, ksiloze, saharoze, arabinoze ipd.), vendar pa so ti odvisni od eksogenega signala, ki direktno inducira izražanje pod nekim promotorjem. Možno alternativo predstavlja uporaba sistemov za zaznavanje celične gostote (ang. quorum sensing, QS), ki predstavljajo izražanje genov na podlagi gostote celic, brez potrebe po eksogenem induktorju. V raziskavi so se osredotočili na optimizacijo regulacije biosinteze hialuronske kisline [1].

Hialuronska kislina (HA) je glikozaminoglikan, sestavljen iz ponavljajočih disaharidnih enot N-acetil-D-glukozamina in D-glukoronske kisline. Njena glavna naloga v bakterijah je kot virulenčni faktor, v vretenčarjih pa predstavlja pomemben del zunajceličnega matriksa, hrustanca, hkrati pa opravlja vloge kot signalna ali vezavna molekula pri embriogenezi, angiogenezi, celjenju ran ipd. Tradicionalno pridobivanje za aplikacije v zdravstvu, industriji in kozmetiki je vključevalo ekstrakcijo iz živalskih tkiv, dandanes pa je v uporabi predvsem mikrobna fermentacija. V tem procesu encim hialuronan sintaza katalizira polimerizacijo osnovnih gradnikov HA. Ker je HA polimer, ga najdemo v zelo različnih dolžinah, pri čemer se je izhodiščni članek fokusiral na HA z nizko molekulsko maso. Pri njih je postopek sinteze še nekoliko bolj poseben, saj potrebujemo še encim hialuronidazo, ki dolg polimer cepi do primernih dolžin [2, 3]. Primer je hialuronidaza SthHL, ki omogoča nastanek molekul HA primernih dolžin, vendar je ta regulacija v prejšnjih študijah potrebovala indukcijo s ksilozo, kar so v tej raziskavi skušali odpraviti [1].

Oris izdelave sinteznobiološkega vezja

Raziskovalci so izdelali avtoinducibilno molekulsko stikalo v šasiji Bacillus amyloliquefaciens, ki je predstavljalo regulatorni mehanizem pri biosintezi HA z nizko molekulsko maso. Sistem vključuje dve glavni komponenti – proteolitski sistem PaSspB-ssrA (odgovoren za razgradnjo encimov, ki omejujejo hitrost rasti) in sistem za zaznavanje celične gostote DegU-RapG-PhrG (omogoča regulacijo molekulske mase HA glede na gostoto celic). Cilj raziskave je bil povečati količino nastale HA ter producirati sistem, ki bi omogočal »programirano« modulacijo molekulske mase HA [1].

Glavni koraki pri izdelavi molekulskega stikala so:

1. konstrukcija in optimizacija proteolitskega sistema, ki bi deloval kot OFF stikalo za metabolizem in bil preusmeril metabolizem proti sintezi prekurzorjev HA

2. Uporaba QS sistema in ustreznega promotorja kot ON stikala za od celične gostote odvisno transkripcijo

3. Priprava šasije, ki bi producirala čim večjo količino produkta (»knockout« mutante)

4. Priprava z rastjo povezanih genov z dodanimi oznakami ssrA, ki bi skupaj s QS sistemom avtoinducirali ekspresijo hialuronidaze SthHL in proteina PaSspB (slednji prepozna ssrA oznake in jih dostavi do proteaz za razgradnjo)

Delovanje in optimizacija vezja

SspB-ssrA proteolitski sistem

SspB-ssrA sistem v prokariotih omogoča proteolizo tarčnih proteinov preko prepoznave ssrA oznake s strani SspB proteina. Slednji dostavi prepoznan protein na kompleks ClpXP proteaze, kjer potečeta razvitje proteina in razgradnja s pomočjo ATP [4]. Znanstveniki so preverjali fluorescenco RFP (Red Fluorescent Protein) brez in z dodano ssrA oznako, pri čemer je prišlo do popolne atenuacije signala. Zato so delno modificirali nativno ssrA oznako, da bi omogočala, da se fluorescenca hkrati večja s časom fermentacije, hkrati pa da pride do hitrejše razgradnje proteina zaradi dodane oznake. V ta namen so testirali štiri različne SspB proteine različnih bakterij (E. coli, B. amyloliquefaciens, B. subtilis in Pantoea alhagi) in preverili do kakšne mere razgrajujejo z ssrA označen RFP. Najprimernejši je bil PaSspB iz bakterije P. alhagi, pri kateri je prišlo do 37 % zmanjšanja fluorescence [1].

DegU-RapG-PhrG sistem za zaznavanje celične gostote

QS sistemi omogočajo regulacijo ekspresije genov brez eksogenih induktorjev, in sicer preko aktivacije promotorja glede na celično gostoto. Za po Gramu negativne bakterije se običajno uporablja sistem na osnovi acil homoserin laktona (AHL), ki pa ni kompatibilen z po Gramu pozitivnim rodom Bacillus. V tej raziskavi so uporabili sistem DegU-RapG-PhrG iz B. subtilis, ki deluje na principih fosforilacijske kaskade in antagonizma med peptidi, ki so v sistem udeleženi.

Pri nizki celični gostoti RapG inhibira fosforiliran DegU in prepreči, da bi ta aktiviral promotor PD4. Z višanjem celične gostote pa se akumulira zunajcelični peptid PhrG, ki se veže na RapG in prepreči inhibicijo. S tem se sproži transkripcija genov za PD4 promotorjem.

V raziskavi so znanstveniki konstruirali štiri seve B. amyloliquefaciens, da bi potrdili mehanizem pod PD4 promotorjem. V sev, kjer so izražali RFP pod PD4 promotorjem (odvisinim od DegU), so zaznali visoko fluorescenco. V sevu, kjer so poleg tega še konstitutivno izražali DegU, pa so zaznali padec v fluorescenci in s tem dognali, da v njihovi šasiji fosforiliran DegU deluje kot represor PD4 promotorja.

Ker DegU ni uspešno aktiviral tega promotorja, so poiskali kompatibilen promotor, ki bi se primerno odzival na prisotnost DegU. Našli so nativen promotor v B. amyloliguefaciens s transkriptomsko primerjavo med sevom, ki DegU izraža in sevom iz katerega so ustrezen gen izbili. Izbrali so šest možnih kandidatov in pod temi promotorji izražali RFP. Do največje razlike med ekspresijo pri sevu z in brez DegU je prišlo pri promotorju PispA. Zanj so potrdili tudi njegovo odvisnost od celične gostote, saj je prišlo do njegove indukcije pri optični gostoti nad 4. Ta promotor predstavlja ON stikalo za izražanje proteina, ki se aktivira pri visoki celični gostoti [1].

Metabolno inženirstvo za izboljšanje sinteze HA v B. amyloliquefaciens

Preden so sistema, opisana v prejšnjih podpoglavjih, lahko uporabili za molekulsko stikalo pri sintezi hialuronske kisline, so morali raziskovalci najprej optimizirati biosintezo HA v izbrani šasiji B. amyloliquefaciens. Temelji na ekspresiji hialuronan sintaze SthasA in hialuronidaze SthHL, ki skupaj omogočata de novo sintezo HA z določeno velikostjo iz osnovnih gradnikov UDP-N-acetil-D-glukozamina in UDP-D-glukoronske kisline [1,5]. Med fermentacijo stranski produkti, kot sta laktat in acetat, porabijo okoli 80 % vseh možnih virov ogljika, s čimer se močno zmanjša zmožnost sinteze drugih produktov, npr. hialuronske kisline. Raziskovalci so zato z metodo CRISPR-Cas9n ustvarili »knockout« seve B. amyloliquefaciens, kjer so skušali zmotiti transkripcijo genov, udeleženih v sintezo laktata, acetata in nekaterih direktnih stranskih produktov v sintezi monosaharidnih prekurzorjev HA (genov, ki sodelujejo pri katabolizmu UDP-GlcNAc in UDP-GlcUA). Uporabili so metodo z dvema plazmidoma – enega z zapisom za nikazo Cas9n, drugega s sgRNA. Pri izbitju gena ldh so v mutiranem sevu opazili kar 68-% zmanjšanje v količini laktata. Poleg sevov z enim izbitim genom, so ustvarili tudi seve s kombiniranima dvema ali tremi izbitji genov. Kot najprimernejšo šasijo so izbrali sev z največjim titrom hialuronske kisline, ki so ga določili s HPLC preko primerjave s kalibracijsko krivuljo HA standarda. Izbrani sev je povečal sintezo N-acetilglukozamina za 3,5-krat, kar je omogočilo za 14 % višjo produkcijo HA [1].

Molekulsko stikalo za regulacijo biosinteze HA z nizko molekulsko maso

Za določanje učinkovitosti PaSsspB-ssrA sistema v B. amyloliquefaciens sta bila izbrana encima pfkA in fruA, saj so v predhodnih raziskavah določili, da oba indirektno vplivata na biosintezo hialuronske kisline. 6-Fosfofruktokinaza predstavlja glavni encim, ki omejuje hitrost glikolize. Atenuacija tega encima poveča količino znotrajcelične fruktoze-6-fosfata in s tem njeno dostopnost v sintezi HA. Izbijanje gena za fruA pa je vodilo v približno 25 % zvišanje produkcije HA.

V raziskavi so najprej konstruirali vezje regulirano z eksogenim induktorjem. Represor XylR se veže na promotorsko regijo PxylA in s tem preprečuje transkripcijo genov za SthHL in PaSspB, ob dodatku zunanjega signala (ksiloze), se ta veže na represor in preprečuje represijo obeh genov. V tem vezju je vloga hialuronidaze SthHL cepitev HA, PaSspB pa sproži degradacijo s ssrA označenih PfkA in FruA, s čimer se fluks ogljika v glikolizi preusmeri v sintezo HA gradnikov. V nadgrajenem vezju so indukcijo s ksilozo zamenjali z avtoindukcijo s promotorjem PispA, ki regulira ekspresijo genov SthHL in PaSspB glede na celično gostoto. V eksponentni fazi rasti celic je bil titer hialuronske kisline nizek, z večanjem celične gostote pa je prišlo do aktivacije SthHL in PaSspB, kar je vodilo do stabilizacije rasti celic (manjši del fluksa ogljika gre za glikolizo) in povečanje biosinteze HA. Končni sev s QS regulacijo je produciral 13,5 g/L HA z nizko molekulsko maso, kar predstavlja 28-% povišanje glede na kontrolo [1].

Zaključek

Raziskovalcem je uspelo konstruirati molekulsko stikalo, ki omogoča povečano sintezo hialuronske kisline znotraj enega seva brez potrebe po zunanjih induktorjih ali dodatnih encimih. Zunanje induktorje je nadomestil sistem za zaznavanje celične gostote, ki omogoča preusmeritev metabolizma od glikolize in celične rasti k sintezi hialuronske kisline v fazi, ko energija za rast ni več tako nujna. Ta sistem tako ponuja rešitev nad dolgotrajnih problemom hkratne uspešne rasti celic in produkcije zadostne količine hialuronske kisline. Sistem prav tako ni baziran na dodatku eksogenih encimov (hialuronidaz), ki bi dodatno povečalo kompleksnost sistema, prav tako pa tudi stroške sinteze. Zaradi neodvisnosti od zunanjih induktorjev, sistem omogoča tudi lažje čiščenje HA in odstranitev kontaminant, kar dodatno zniža stroške pri industrijski sintezi (v kozmetični in farmacevtski industriji).

Literatura

[1] Zhong, Q., Li, Z., Duan, W., Lei, P., Xu, X., Xu, H., Li, S. and Qiu, Y. Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch. ACS Synthetic Biology, 2026, 15(3), str. 1008–1020. doi:https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00570.

[2] Palenčárová, K., Köszagová, R. in Nahálka, J. Hyaluronic Acid and Its Synthases—Current Knowledge. International Journal of Molecular Sciences, 2025, 26(15), str. 7028–7028. doi:https://doi.org/10.3390/ijms26157028.

[3] Ucm, R., Aem, M., Lhb, Z., Kumar, V., Taherzadeh, M.J., Garlapati, V.K. in Chandel, A.K. Comprehensive review on biotechnological production of hyaluronic acid: status, innovation, market and applications. Bioengineered, 2022, 13(4), str. 9645–9661. doi:https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2057760.

[4] Alireza Ghanbarpour, Fei, X., Baker, T.A., Davis, J.H. in Sauer, R.T. The SspB adaptor drives structural changes in the AAA+ ClpXP protease during ssrA-tagged substrate delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(6). doi:https://doi.org/10.1073/pnas.2219044120.

[5] Imen Zalila-Kolsi, Afif Ben‐Mahmoud in Al-Barazie, R. Bacillus amyloliquefaciens: Harnessing Its Potential for Industrial, Medical, and Agricultural Applications—A Comprehensive Review. Microorganisms, 2023, 11(9), str. 2215–2215. doi:https://doi.org/10.3390/microorganisms11092215.