Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi
Uvod
Bakterijski ribosom se deli na majhno in veliko podenoto. Majhna podenota (30S) ribosoma E. coli (70S) obsega 16S rRNA, velika podenota (50S) pa 23S rRNA in 5S rRNA. Obe podenoti vsebujeta še ribosomske proteine [1, 2]. Ribosomi so ključni za prevajanje matrice mRNA v aminokislinsko zaporedje. Zaradi njihove osrednje vloge pri omenjenem procesu, si znanstveniki prizadevajo načrtovati podenote ribosomov, ki bi nam omogočali širše razumevanje procesa translacije, lažje razumevanje sestave in delovanja ribosomov ter njihovo uporabo v biotehnologiji. Kljub temu nekateri izzivi otežujejo spreminjanje naravne rRNA. Funkcija ribosomov je ključna za življenje, zato je uvajanje več mutacij v rRNA za celico smrtno. Na ta način viabilnost celic omejuje, koliko mutacij lahko vnesemo v rRNA. Naslednja težava je veliko možnosti za uvajanje različnih mutacij, kar omejuje eksperimentalno preučevanje. Poleg tega pa so fizikalno-kemijske in dinamične lastnostni ribosoma prilagojene za prevajanje peptidne verige sestavljene iz nabora 20 aminokislin, kar otežuje spreminjanje njegove strukture [1].
Skupnostna znanost se kaže kot možnost za pristop k načrtovanju struktur in funkcij rRNA. V članku so Krüger in sodelavci sodelovali s platformo Eterna. Eterna je spletna igra, v kateri lahko sodelujejo ljudje iz vsega sveta – igralci z zanimanjem za znanost in reševanje ugank. Ti rešujejo uganke o načrtovanju sekundarnih struktur RNA po omejitvah, ki sledijo termodinamskim modelom. Igralci po opravljenem uvajanju v igro načrtujejo sekundarne strukture RNA in oddajo 'rešitve' ugank ter nato z glasovanjem izberejo podmnožico najboljših, katere nato raziskovalci pripravijo v svojih laboratorijih. Igralci si med sabo delijo strategije načrtovanja in pomagajo pri razumevanju igre preko klepeta v igri ali spletnega foruma. Kljub napredkom v skupnostni znanosti in računalniškim metodam do danes še ni nihče načrtoval RNA, ki bi ustrezala velikosti in kompleksnosti celotnega bakterijskega ribosoma [1].
Skupina Krüger in sod. je razvila pristop načrtovanje-izgradnja-testiranje-učenje (angl. design-build-test-learn, DBTL), ki so ga vključili v sodelovanje s platformo Eterna. S tem bi ustvarili nova zaporedja bakterijskih ribosomov z izboljšano energetsko sekundarno strukturo rRNA. Njihov pristop je vključeval sodelovanje skupnostne znanosti (igralci igre Eterna), raziskovalce in razvijalce iger [1].
Igralci platforme Eterna so načrtovali ribosome, ki so bili boljši od računalniško načrtovanih
Najprej je bil izveden pilotni krog načrtovanja ribosomskih podenot 16S in 23S rRNA s pristopom DBTL na platformi Eterna. V fazi načrtovanja so igralci načrtovali nova rRNA zaporedja s spreminjanjem posameznih nukleotidov. Kritična mesta nukleotidov so bila zaklenjena za spreminjanje in so bila enaka kot v divjem tipu (DT). Zaporedja sekundarnih struktur so bila ocenjena z Gibbsovo prosto energijo (∆G). Cilj je bil doseči še vedno funkcionalne sekundarne strukture rRNA z izboljšano ∆G v primerjavi z DT. Igralci so med igranjem lahko razpravljali o izzivih načrtovanja rRNA in si izmenjevali materiale. Po 15 tednih so med vsemi strukturami izglasovali osem mutant podenote 16S rRNA in osem mutant 23S rRNA. Podenote 16S so vsebovale 2-55 mutacij in podenote 23S od 1-72 mutacij. V fazi izgradnje so raziskovalci sintetizirali izbrana zaporedja DNA in jih vključili na določeno mesto za 16S oziroma 23S rRNA v plazmid pT7-rrnB. Plazmid kodira za operon rrnB, ki vključuje zapis za 16S rRNA, 23S rRNA in 5S rRNA, in je pod promotorjem T7. V fazi testiranja so nato mutante 16S in 23S rRNA testirali v in vitro sistemu z integriranim pristopom sinteze, sestavljanja in prevajanja (iSAT). Metoda iSAT omogoča rRNA in mRNA transkripcijo iz plazmida, sestavljanje rRNA z nativnimi ribosomskimi proteini v ribosome in translacijo proteinov. To poteka v eni reakcijski mešanici v celičnem ekstraktu S150 brez nativnih ribosomov. Ribosomi imajo v sistemu iSAT nižjo aktivnost kot in vivo. V fazi učenja so znanstveniki delili ugotovitve iz testiranj z igralci. Te rezultate so igralci interpretirali in o rezultatih razpravljali na spletnem forumu [1].
Šest od izbranih 16S rRNA in sedem 23S rRNA konstruktov je bilo funkcionalnih v testiranju z iSAT. Aktivnosti so bile med 12 in 96 % v primerjavi z DT. Aktivnost podenot 16S in 23S so primerjali z aktivnostjo računalniško načrtovanih podenot z enakim številom mutacij in enakimi zahtevami za tvorbo sekundarnih struktur. Igralci so pri načrtovanju kljub dodanim >20 mutacijam (16S rRNA) ali >40 mutacijam (23S rRNA) uspeli ohraniti aktivnost ribosomov podobno DT, medtem ko so bile vse računalniško načrtovane strukture z več kot 4 mutacijami neaktivne z iSAT [1].
Izboljšan pristop DBTL pri načrtovanju ribosomov
Po pilotnem krogu so ugotovili, da bi enak pristop DBTL omejeval napredek projekta. Uganke so bile težavne za reševati, ker so se strukture lahko med sabo prekrivale zaradi predstavitve v 2D prostoru, kar je onemogočalo spreminjanje določenih baz. V novem krogu je pristop DBTL potekal med igralci, znanstveniki in razvijalci iger na vseh področjih - ustvarjanje ugank, izdelave orodij in pri pripravi rRNA. Izvedli so nov izziv »OpenRibosomeChallenge« na platformi Eterna s ciljem ustvariti še stabilnejše strukture rRNA, ki bi imele izboljšano iSAT aktivnost. Nova različica je imela Eterna prostor v 3D okolju, poleg tega so bila kritična mesta nukleotidov odklenjena za spreminjanje. Spremembo so uvedli, ker je v pilotnem krogu to omejevalo kreativnost igralcev, poleg tega pa so ugotovili, da niso vsi ostanki, ki so v začetku veljali za nespremenljive, popolnoma ohranjeni med sorodnimi bakterijami E. coli [1].
Izvedli so dva kroga (R1 in R2) omenjenega izziva. Po koncu vsakega kroga so izbrali 20 načrtovanih struktur 16S rRNA in 23S rRNA, ki so jih sintetizirali in testirali pri optimalnih pogojih v iSAT. Po vsakem krogu so rezultate delili z igralci, kar jim je pomagalo pri izboljševanju načrtovanih struktur. Na primer, konstrukti v R1 in R2 so imeli višjo aktivnost in večje število mutacij kot v pilotnem krogu [1].
Igralci so oblikovali več strategij reševanja struktur: optimizacija energije sekundarnih struktur, minimizacija sekvenčnih ponovitev. Ob uvajanju mutacij, so igralci v večini menjevali bazne pare (AU za CG in obratno) ter spreminjali ne-Watson–Crick bazne pare v Watson–Crick bazne pare. Poleg tega so igralci uspešno uvedli mutacije iz drugih bakterij, ki so znane, da imajo dobre zmožnosti sestavljanja RNA, uporabljali pa so tudi mutacije uvedene v prejšnjih krogih. Igralci so ugotovili, da se je dobro izogibati spreminjanju nukleotidov, ki so neposredno povezani z ribosomskimi proteini [1].
Za karakterizacijo robustnosti Eterna rRNA konstruktov so raziskovalci izbrali vse konstrukte iz R1 in R2 z ≥ 6 mutacijami, ki so imeli aktivnost ≥ 80 % DT pri optimalnih pogojih v iSAT, in jih testirali pod stresnimi pogoji zvijanja (nizka koncentracija Mg2+ in optimalna ali nizka temperatura). Konstrukti so v večini kazali robustnost, predvsem R1 16S rRNA konstrukti. Izmed teh so izbrali 18 konstruktov, katere so testirali v nefizioloških pogojih: v prisotnosti organskih topil ali pri spremenjenem pH. Nekateri konstrukti so imeli pri teh pogojih tudi izboljšano zmožnost delovanja kot DT [1].
Združevanje načrtovanih konstruktov Eterna rRNA poveča in vitro aktivnost ribosomov
Raziskovalci so nato združili konstrukte 16S rRNA in 23S rRNA, ki so jih pripravili igralci, in preverili vpliv na aktivnost ribosomov in vitro. Izbrali so skupno tri konstrukte 16S rRNA in dva konstrukta 23S rRNA, ki so imeli najboljšo kombinacijo raznolikosti zaporedja, aktivnost z iSAT in toleranco na stresne pogoje. Vse kombinacije ribosomov so testirali z iSAT. Pri tem je ena od kombinacij kazala tudi 42 ± 10 % večjo aktivnost kot DT v optimalnih kot tudi stresnih pogojih. Ugotovili so, da je izboljšana funkcija ribosomov posledica hitrejšega sestavljanja ribosoma in hitrejše sinteze proteina. Hitrost sestavljanja ribosoma so preverili z analizo ribosomske sedimentacije, kjer so zaznali hitrejši pojav višjih vrhov pri 70S in polisomih. Hitrejšo sintezo proteina so preverili s testiranjem sestavljenih ribosomov iz metode iSAT [1].
Ribosomi, ki so jih načrtovali igralci Eterne, delujejo in vivo
Kljub omenjenemu glavnemu izzivu pri načrtovanju ribosomov, da je veliko mutacij v rRNA smrtnih za celico, so raziskovalci preizkusili načrtovane ribosome in vivo. Kombinacije konstruktov iz R2 so vstavili v plazmid pL-rrnB pod kontrolo temperaturno odvisnega promotorja in z njimi transformirali sev bakterije E. coli, ki nima zapisa za rRNA. Večina konstruktov 16S rRNA in 23S rRNA je omogočala preživetje bakterijam, od tega tudi eden, ki ni bil aktiven z metodo iSAT. Predvidevajo, da bi to lahko bila posledica težav pri sestavljanju in vitro, ki je odpravljena v sistemu in vivo. Ugotovili so, da je kombinacija obeh mutiranih podenot ribosomov združljiva z življenjem. Očiščene mutante ribosomov so bile zmožna sinteze proteinov tudi brez prisotnosti celic v prisotnosti ekstrakta S150. Aktivnost je bila primerljiva z DT [1].
Zaključek
V članku so raziskovalci ugotovili, da mutirana zaporedja rRNA lahko kažejo koristne fenotipske lastnosti ribosomov. In vitro lahko ribosomi, ki so jih načrtovali igralci Eterne, testirani z iSAT, presežejo aktivnost DT in so manj občutljivi na stresne pogoje. Od tega je več kot 85 % načrtovanih ribosomov omogočalo preživetje celic. V tej študiji je bila tudi prvič uporabljena skupnostna znanost pri načrtovanju ribosomov, kar se je izkazalo za prednost pred računalniškim napovedovanjem. Pravila, ki so jih vzpostavili igralci Eterne, bi lahko bila vodilo za razvoj novih algoritmov pri načrtovanju ribosomov. Raziskovalci menijo, da bo pristop DBTL pomemben pri načrtovanju kompleksnih RNA struktur za uporabo v sintezni biologiji ter pri pridobivanju poglobljenega znanja o povezavi med zaporedjem, zvijanjem in funkcijami RNA [1].
Literatura
[1] A. Krüger, A. M. Watkins, R. Wellington-Oguri, J. Romano, C. Kofman, A. DeFoe, Y. Kim, J. Anderson-Lee, E. Fisker in sod.: Community science designed ribosomes with beneficial phenotypes. Nat. Commun. 2023, 14(1).
[2] H. Gao, J. Sengupta, M. Valle, A. Korostelev, N. Eswar, S. M. Stagg, P. Van Roey, R. K. Agrawal in S. C. Harvey: Study of the Structural Dynamics of the E. coli 70S Ribosome Using Real-Space Refinement. Cell 2003, 113(6), 789-801.
