Uravnavanje evolucijskega potenciala s številom kopij plazmida in regulatorno arhitekturo

Izhodiščni članek: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41476172/

UVOD

Genetski moduli v sintezni biologiji so pogosto zasnovani po analogiji z inženirskimi sistemi. Čeprav je ta pristop lahko uspešen zaradi podobnosti med fizikalnimi in biokemičnimi sistemi, zanemarja ključni dejavnik, ki vpliva na delovanje živih organizmov: evolucijo. Medtem ko so električna vezja statična in nespremenljiva, so genetski sistemi podvrženi stalnim mutacijam in evolucijskemu pritisku, kar sčasoma vodi do postopne okvare funkcije.

Zato je pri načrtovanju sintetičnih bioloških sistemov nujno upoštevati ravnotežje med dvema ključnima lastnostma: evolucijskem potencialnom, zmožnost generiranja novih funkcij in evolucijsko stabilnostjo, ohranjanje obstoječe funkcije kljub mutacijam. Avtorja sta z združevanjem računskega modeliranja in poskusov in vivo mutageneze v bakteriji E. coli opisala, kako medsebojno delovanje genskega odmerka preko števila kopij plazmida – PCN in regulatorne arhitekture vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo.

Plazmidi kot nosilci sintetičnih vezij igrajo pomembno vlogo, saj so prisotni v več kopijah v vsakem gostitelju in omogočajo hitro evolucija preko genske amplifikacije. Visok PCN poveča genetsko raznolikost znotraj celice (heterozigotnost) in omogoča učinkovitejše prilagajanje, hkrati pa olajša širjenje genov med bakterijami preko horizontalnega prenosa. To ima velik pomen za lastnosti, kot so odpornost na antibiotike in razgradnje toksičnih snovi.

METODE: EvolvR SISTEM IN RAČUNSKI MODEL

Uporabljali so in vivo sistem za ustvarjanje mutacij z uporabo sistema EvolvR. To je izboljšana Cas9 nikaza, spojena z modificirano error-prone DNA polimerazo. Sistem usmerja usmerjevalna RNA, imenovana sgRNA, tako da povzroča ciljne mutacije na izbranem mestu. Izražanje EvolvR je inducibilno z arabinozo, kar omogoča časovno regulacijo mutacijskega procesa. Eksperimentalni sistem vključuje dva glavna plazmida: prvi vsebuje EvolvR in sgRNA, drugi pa tarčne gene na plazmidih z različnimi variantami pSC101, ki omogočajo različna števila kopij v celici. Tarčni geni vključujejo okvarjen fluorescenčni protein sfGFPd, okvarjen gen za odpornost na antibiotik ampRd ter regulatorni gen lacI.

Da bi ločila vpliv števila kopij plazmidov od vpliva ekspresije genov, sta avtorja uporabila dodatne regulacijske konstrukte. Eden ključnih je IFFL (incoherent feed-forward loop), ki omogoča konstantno raven ekspresije proteina ne glede na PCN, saj povečanje števila kopij hkrati poveča tudi represijo. Poleg tega sta uporabila negativno avtoregulacijo, kjer protein LacI regulira lastno izražanje, ter TetR represijski sistem za zmanjšanje neželenih mutacij zunaj ciljnih regij. Ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo in analizo vpliva mutacij na fenotip.

Da bi raziskali, kako genski odmerek vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo, sta avtorja razvila prirejeno različico standardnega Wright-Fisherjevega modela za multiploidne populacije, saj PCN običajno presega dva. Model ima diskretne generacije s konstantno velikostjo populacije N = 10⁵, verjetnost mutacije μ = 2,5 × 10⁻⁶ na nukleotid na generacijo.

Postopek v vsaki generaciji poteka v štirih korakih. V prvem koraku vsak plazmid divjega tipa mutira z verjetnostjo μ, kar modelirajo kot Poissonov proces. Nato se posodobijo števila plazmidov divjega tipa in mutiranih plazmidov. V drugem koraku se število novih plazmidov po replikaciji ustvari v skladu s Poissonovo porazdelitvijo s povprečjem, enakim povprečnemu PCN. Ta bazen se nato razdeli po binomski porazdelitvi, tako da so novi plazmidi naključno dodeljeni kot divji tip ali mutirani glede na razmerja v celici. V tretjem koraku obe hčerinski celici prejmeta približno polovico plazmidov. Hipergeometrična porazdelitev določi, kako so mutirani in nemutirani plazmidi porazdeljeni. V četrtem koraku se naključno izbere polovica populacije za naslednjo generacijo, preostanek pa se zavrže, tako da velikost populacije ostane konstantna.

REZULTATI

Rezultati simulacij pokažejo tri ključne trende. Prvič, delež celic, ki vsebujejo vsaj en mutiran plazmid, narašča z večjim PCN. Drugič, absolutno število mutiranih plazmidov znotraj posamezne celice prav tako narašča s PCN. Tretjič pa, relativni delež mutiranih plazmidov na celico pada s PCN, saj večje število nemutiranih kopij zmanjša relativni vpliv mutacij. To pomeni, da višji PCN povečuje genetsko raznolikost na ravni populacije, hkrati pa omogoča kompenzacijo mutacij na ravni posamezne celice.

MUTACIJE, KI POVZROČIJO PRIDOBITEV FUNKCIJE

Avtorja sta eksperimentalno preverila napovedi modela s preprostim genskim vezjem, sestavljenim iz dveh plazmidov. Prvi plazmid z izvorom replikacije p15A vsebuje sistem EvolvR in sgRNA, oba izražena z arabinoza-inducibilnim PBAD promotorjem. Drugi plazmid vsebuje pSC101 varianto izvora replikacije s številom kopij (PCN) med 3 in 25 na kromosom ter vsebuje konstitutivno izražen sfGFP z okvaro. Okvara je posledica zamenjave metionina s stop kodonom, kar povzroči nefluorescentnost. Ob dodatku arabinoze se aktivira EvolvR, ki lahko popravi stop kodon in tako ponovno vzpostavi fluporescenco, kar predstavlja mutacijo, ki povzroči pridobitev funkcije.

Rezultati pretočne citometrije so pokazali, da manj kot 1% celic izraža visoko raven izražanja sfGFP. Fenotipska mutacijska stopnja brez dodatne regulacije narašča s povečanjem PCN, saj večje število kopij pomeni več tarčnih mest za mutacije in s tem večje število novonastalih mutacij. Vendar pa večji PCN hkrati poveča tudi skupno koncentracijo izraženega proteina, kar moti interpretacijo rezlutatov, saj ni jasno, ali spremembe izvirajo iz mutacij ali iz povečane ekspresije.

Zato so avtorji vključili IFFL (incoherent feed-forward loop) regulacijski modul, ki omogoča konstantno izražanje tarčnega proteina ne glede na PCN. V tem primeru koncentracija sfGFP narašča s številom mutiranih plazmidov, vendar je prispevek posameznega mutiranega plazmida k skupni koloičini proteina manjši pri višjem PCN zaradi represije. Posledično se pojavita dva nasprotujoča si učinka: večje število mutiranih kopij povečuje verjetnost zaznavnega signala, hkrati pa posamezna mutacija prispeva manj funkcionalnega proteina.

Kateri učinek prevlada, je odvisno od detekcijskega praga fenotipa. Pri nizkem pragu, kot je odpornost na antibiotik, zadostuje že majhna količina funkcionalnega proteina. Zato drugi učinek ni pomemben in fenotipska mutacija monotono narašča s PCN. To so avtorji dodatno potrdili z eksperimentom z okvarjenim genom ampRd, kjer so celice po indukciji gojili na gojišču z ampicilinom – preživele so le tiste, pri katerih mutacija je obnovila funkcijo gena. Število preživelih kolonij je naraščalo s PCN, kar jasno kaže na prevladujoč vpliv povečane mutacijske oskrbe. Pri višjem detekcijskem pragu, kot je fluorescenčni signal, pa mora biti količina proteina dovolj veilka, da jo zaznamo. V tem primeru lahko pride do nemonotone odvisnosti, kjer mutacijska stopnja najprej narašča, nato začne padati, kar so opazili tako v simulacijah kot eksperimentih.

MUTACIJE, KI POVZROČIJO IZGUBO FUNKCIJE

Pri mutacijah tipa, ki povzročijo izgubo funkcije, kjer mutacija uniči funkcijo gena (na primer mutacija lacI, ki povzroči izgubo represije), je trend obraten. Fenotipska mutacijska stopnja se zmanjšuje z naraščajočim PCN. Razlog je v tem, da nemutirane kopije gena še vedno proizvajajo funkcionalni protein, ki kompenzira učinek mutacije.

MUTACIJE V KODIRAJOČI IN REGULATORNI REGIJI

Mutacije v kodirajoči regiji pogosto povzročijo nefunkcionalne proteine, vendar so njihov učinek pogosto kompenziran z drugimi, nemutiranimi kopijami gena. Zato njihov fenotipski vpliv upada z večjim PCN. Nasprotno pa mutacije v regulatornih regijah, kot so promotorji ali vezavna mesta za regulatorje, niso kompenzirane na enak način. Ena sama mutirana kopija promotorja lahko vodi do izražanja gena ne glede na stanje drugih kopij. Zato se njihov fenotipski učinek povečuje z večjim PCN. To pomeni, da so regulatorne mutacije pogosto dominantne ali kodominantne, medtem ko so mutacije v kodirajočih regijah pogosto recesivne.

Regulatorni konstrukti igrajo ključno vlogo pri oblikovanju teh učinkov. IFFL modul omogoča stabilno ekspresijo ne glede na število kopij in s tem razkriva subtilne učinke mutacij. TetR represijski sistem zmanjšuje neželene mutacije izven ciljnih regij in izboljšuje natančnost eksperimentov. Skupaj ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo evolucijskih lastnosti sistema.

ZAKLJUČEK

Na podlagi rezultatov pridemo do zaključka, da fenotipski učinek mutacij ni odvisen zgolj od narave mutacije, temveč tudi od konteksta, v katerem se mutacija pojavi. Ključna dejavnika sta število kopij gena in regulatorna arhitektura. Višji PCN poveča evolucijski potencial, saj omogoča več mutacij in večjo genetsko raznolikost, vendar hkrati zmanjša vpliv posamezne mutacije zaradi kompenzacije. Mutacije, ki povzročijo pridobitev funkcije se obnašajo dominantno in postajajo pogostejše z večjim PCN. Mutacije, ki povzročijo izgubo funkcije so recesivne in njihov fenotipski vpliv upada, medtem ko regulatorne mutacije pogosto kažejo dominantno ali kodominantno vedenje. Ti rezultati imajo pomembne implikacije za sintezno biologijo. Z ustrezno izbiro števila kopij plazmidov in regulatornih mehanizmov je mogoče načrtovati sisteme, ki so bodisi evolucijsko stabilni bodisi sposobni hitrega prilagajanja. Poleg tega izbira tarčnega mesta mutacije bistveno vpliva na evolucijski izid: mutacije v regulatornih regijah imajo večjo verjetnost fenotipskega učinka kot mutacije v kodirajočih regijah.

VIRI

1. Li, X., & Gyorgy, A. (2025). Tuning evolvability via plasmid copy number and regulatory architecture. Nature Communications, 17(1), 1230. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67995-9