Viruguard – izboljšani onkolitični adenovirusi proti raku na jetrih
UVOD
Rak jeter je resen javnozdravstveni problem, ki ga je treba nujno obravnavati po vsem svetu. Tradicionalna zdravljenja, vključno s kirurško radioterapijo in kemoterapijo, niso zadovoljiva pri zdravljenju raka jeter zaradi stranskih učinkov. Zato so se v skupini ZJU-China odločili razviti novo vrsto onkolitičnega virusa za zdravljenje hepatoceličnega karcinoma (HCC). Kot orožje za ubijanje malignih celic in odpravljanje morebitne virulence, ki jo povzročajo onkolitični virusi so uporabili RNAi. Poleg tega so povečali tudi specifičnost virusa za ciljanje na tumorskih celic in zmanjšali zgodnje odstranjevanje virusa zaradi bolnikovega imunskega sistema. [1]
IDEJA
Ker je rak jeter zelo pogosta oblika raka na kitajskem, se je ekipa ZJU-China odločila, da najdejo rešitev za zdravljenje te zelo smrtne bolezni. Svoj onkolitični virus je skupina poimenovala ViruGuard. Z močnim orožjem, mehanizmom RNAi, je onkolitični virus pridobil sposobnost učinkovitega ubijanja rakavih celic. Poleg tega so opazili, da je virulentnost virusa lahko problematična, zato so vložili veliko truda, da bi povečali varnost tovrstnega zdravljenja. Da bi dosegli ta cilj, so zasnovali več korakov, s katerimi bi omejili delovanje virusa. Da bi imeli celovito razumevanje, kako bo virus vplival na človeško telo, so na podlagi objavljenih podatkov razvili model, ki posnema onkolitični proces. Ta model je ponazoril dinamično spremembo celotnega procesa in dokazal teoretično učinkovitost projekta [1]. Zdravljenje ni edini način za boj proti tumorju, bistvenega pomena je tudi zgodnja diagnoza. Prej ko je tumor odkrit, več je upanja za zdravljenje. Onkolitičnega virusa ni mogoče uporabiti brez zanesljive diagnoze. Zato so razvili čip za biološki test, ki bi lahko zaznal specifične znake na jetrnih rakavih celicah. Ta metoda je enostavna za uporabo, saj zahteva le majhno količino tkiva ali celo krvi. Hkrati pa je tudi cenovno ugodna in omogoča zgodnje presejanje [1].
PREDHODNE RAZISKAVE
Tradicionalni načini zdravljenja raka jeter vključujejo operacijo in radioterapijo.[2] Kemoterapija povzroči veliko obremenitev jeter in drugih organov, večina vrst jetrnih rakov pa ni občutljiva na kemoterapijo, zato tovrstna metoda ni optimalen način zdravljenja raka jeter. V zadnjih 10 do 20 letih je bilo opravljenih precej raziskav onkolitičnih virusov in večina jih je uporabljala samo en mehanizem za zdravljenje ali pa se je ukvarjala le z enim vidikom zdravljenja tumorja. Poleg tega je večina onkolitičnih virusov ostala v predklinični fazi in odobrenih je bilo le nekaj izdelkov. V predkliničnih študijah se jih je veliko osredotočilo na zdravljenje HCC, medtem ko v študijah kliničnega stadija skorajda ni nobenih onkolitičnih študij [3, 4]. Ker je imela večina že testiranih onkolitičnih adenovirusov stranske učinke na bolnika, so se odločili povečati varnost onkolitičnega virusa in izboljšati njegovo učinkovitost s kombiniranjem več mehanizmov hkrati, da bi dosegli namen zdravljenja [1].
IZOGIB IMUNSKEMU ODZIVU
Človeški avtoimunski sistem je eden glavnih razlogov, zakaj drugi podobni izdelki niso mogli doseči pričakovanega učinka. Zato so poskušali začasno zakamuflirati onkolitični virus v procesu prepoznavanja imunskega sistema, da bi zagotovili, da lahko onkolitični virus stabilno vdre in se razmnožuje po injiciranju v tumor. Prvi korak, da imunska celica prepozna adenovirus in začne naslednje imunsko vedenje, je medsebojna povezava med receptorjem TLR9 na površini imunskih celic in specifičnim zaporedjem CpG v genomu virusa. Toll-like receptor 9 (TLR9) lahko prepozna DNA patogenih virusov in bakterij, ki vsebuje nemetilirano zaporedje citozin gvanin fosfata (CpG). Kombinacija CpG in TLR9 spodbuja njegovo dimerizacijo in aktivira signal TLR9 prek signalnega liganda MyD88 za proizvodnjo interferonov (IFN) in provnetnih citokinov, sprožitev imunskega odziva in odpravo tujih antigenov. Mehanizem varuje naše zdravje v vsakdanjem življenju. Za ViruGuard je ta proces nezaželjen, zato smo morali najti način, kako začasno zmanjšati njegovo delovanje. Nedavna študija je pokazala, da se lahko zaporedje DNA TLR9i (interferenca TLR9) uporabi za motenje delovanja receptorja TLR9. Vezavno mesto oligonukleotida TLR9i na TLR9 se delno prekriva s CpG DNA, vezavna afiniteta za TLR9 pa je višja kot CpG DNA. Struktura matičnega obroča, ki jo tvori oligonukleotid TLR9i, je tesno vdelana v obročno strukturo TLR9, da prepreči dimerizacijo in aktivacijo TLR9. Z vstavitvijo sekvence TLR9i v genom Ad5, se bo TLR9i konkurenčno vezal na TLR9. Zaporedje TLR9i ima močnejšo afiniteto za vezavo TLR9 kot zaporedje CpG in ne bo povzročilo aktivacije receptorja TLR9, ko se veže na receptor. Na ta način bi imunski sistem zmanjšal zgodnji odziv imunskega sistema proti virusu, zaradi česar lahko virus uspešno vstopi v rakave celice [1].
MODIFICIRANA POVRŠINSKA FUZIJSKA VLAKNA
Adenovirus prepozna in veže celice preko dveh interakcij. Najprej fibrilarni protein v adenovirusni kapsidi medsebojno deluje s celičnim receptorjem CAR na celični površini, da omogoči pritrjevanje virusa na celico; nato pa adenovirusni penton bazni protein in vezava integrina αvβ3 in αvβ5 na celično površino inducirata endocitozo in omogočita virusu vstop v celico. Če primerjamo tumorske celice z normalnimi celicami, je izražanje CAR v tumorskih celicah manjše kot v normalnih celicah, zaradi česar je adenovirus bolj nagnjen k temu, da se veže na normalne celice in jih okuži, kar je eden od razlogov za hude stranske učinke in nizko specifičnost. Pri HCC, ki so ga preučevali, je na površini rakavih celic jeter posebej izražen receptor GPC3, ki ne obstaja na površini normalnih celic. S spajanjem adenovirusa z anti-GPC3 scFv, ki lahko združuje celice HCC, specifično izraženega receptorja GPC3, se znatno zmanjša možnost vezave virusa na normalne celice in poveča možnost vezave virusa na rakave celice jeter. Zato lahko anti-GPC3 scfv ne le poveča varnost z omejevanjem procesa CAR v normalnih celicah, ki združujejo virus, ampak tudi izboljša specifičnost in učinkovitost okužbe z virusom ViruGuard [1].
miRNA MODULIRA PROLIFERACIJO VIRUSA
Med normalnimi celicami in tumorskimi celicami obstajajo specifične razlike v izražanju miRNA. Ta razlika v ravni miRNA je bila uporabljena za uravnavanje usode genoma virusa po vstopu v celico. Upali so, da bodo to razliko uporabili za spremljanje specifične replikacije virusa v tumorskih celicah in zmanjšali proliferacijo in sposobnost preživetja virusa v normalnih celicah z nadzorom izražanja ključnih proteinov virusa. Izbrali so tri različne miRNA kot stikalo za nadzor preživetja virusa: miRNA 199a, 195 in 22, ki so bile izražene višje v normalnih celicah kot v tumorskih celicah. Z vstavljanjem komplementarnega zaporedja teh visoko izraženih miRNA v 3' UTR E1A. E1A je bistven gen za preživetje virusa in kombinacija prostih miRNA in njihovega komplementarnega zaporedja v 3'UTR gena bi povzročila utišanje gena, kar bi zaviralo širjenje virusa. V tumorskih celicah ima zaradi nižje izraženosti teh genov miRNA majhen učinek na sposobnost preživetja virusa. Da bi zmanjšali zaviralni učinek mehanizma za utišanje proste miRNA na onkolitični virus v rakavih celicah, so oblikovali posebno sekvenco, imenovano 'goba miRNA', ki je sestavljena iz niza tandemskih komplementarnih sekvenc miRNA 199a, 195 in 22. Prepisana mRNA lahko zmanjša raven zgoraj omenjene proste miRNA s komplementarno vezavo, ki omejuje sposobnost teh vrst prostih miRNA, da se vežejo na ciljni položaj gena E1A onkolitičnega virusa. Da bi zagotovili, da ta mehanizem ne bo vplival na mehanizem za utišanje virusa v normalnih celicah, so uporabili za tumor specifičen promotor hTERT za uravnavanje njegove transkripcije. V normalnih celicah je ekspresija gobe miRNA sorazmerno nizka, tako da lahko miRNA v normalnih celicah ostane v učinkoviti koncentraciji [1].
SAMOMORILSKI MEHANIZEM RNAi
Uničevalni učinek virusov na tumorske celice izvaja RNAi. S preživetjem tumorja sta povezanaq gena VEGFA in hTERT. Prvi gen nosi sposobnost proizvajanja vaskularnega epidermalnega rastnega faktorja, ki je široko izražen v celicah in močno izražen v tumorskih celicah. Njegovo izražanje omogoča nastanek krvnih žil okoli tumorja, ki zagotavljajo svežo kri za njegovo rast. Zato knockdown VEGFA pomeni stradanje tumorskih celic. Ker bosta gost žilni sistem in obstoj kolagenskih vlaken v ECM zunajceličnega matriksa v tumorju ovirala nadaljnji prenos virusa v tumorju, lahko naša siRNA, ki cilja na VEGFA, učinkovito zmanjša tumorsko angiogenezo in sintezo zunajceličnega matriksa, tako da poveča prenos virusa v tumorju. hTETR pa se izraža samo v malignih tumorjih in človeških zarodkih. Gre za gen telomerne reverzne transkriptaze, ki lahko zmanjša ali celo odpravi skrajšanje telomer zaradi delitve celic in zagotovi neomejeno razmnoževanje tumorskih celic. Zato knockdown hTERT pomeni oslabitev replikacijske sposobnosti rakavih celic. Ko onkolitični virus uspešno lizira celico, nastane nov virus, ki deluje naprej. Ker tumor še ni metastaziral, se bo virus postopoma razširil z našega mesta injiciranja na okoliško rakavo tkivo. Visoka sposobnost prepoznavanja in ciljanja virusa lahko popolnoma uničita tumorske celice in zmanjšata možnost kasnejše ponovitve [1].
POVZETEK
Skupina ZJU-China je uresničila nekaj zelo pomembnih izboljšav za razvoj onkolitičnega virusa, vključno z učinkovitejšo virulenco, modificiranimi proteini za okužbo, specifično za tumorske celice, kombinacijo samomorilskega stikala miRNA in gobe miRNA za specifično proliferacijo virusa v rakavih celicah in mehanizmom ubijanja RNAi. To je "rešitelj raka" – ViruGuard. Zahtevani deli (TLR9i, fuzijski protein vlaken-scFv, E1A-3UTR, goba miRNA, tumor-specifični promotor, hTERT shRNA, VEGFA shRNA) so integrirani v genom adenovirusa. Gre za rekombinantni virus, ki lahko specifično uniči rakave celice jeter [1].
VIRI
[1] Team: ZJU China - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:ZJU-China (pridobljeno 25. 3. 2022)
[2] Rahul Rajeev,T. Clark Gamblin,Kiran K. Turaga. Hepatic Perfusion Therapy[J]. Surgical Clinics of North America, 2016
[3] Tenneti Pavan,Borad Mitesh J,Babiker Hani M. Exploring the role of oncolytic viruses in hepatobiliary cancers.[J]. Immunotherapy, 2018
[4] Lawler SE, Speranza M, Cho C, Chiocca EA. Oncolytic Viruses in Cancer Treatment: A Review. JAMA Oncol. 2017;3(6):841–849. doi:10.1001/jamaoncol.2016.2064
