Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA

Izhodiščni članek: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5c00824

Uvod

Sintetična mRNA omogoča učinkovit pristop vnosa genetske informacije za tvorbo terapevtskih proteinov in vivo. Uspeh mRNA cepiv proti COVID-19 je dodatno potrdil, da gre za izjemno obetaven pristop pri zdravljenju in preprečevanju bolezni. Molekule mRNA so za terapevtsko uporabo enkapsulirane v lipidnih nanodelcih (LNP). Zaradi vseh svojih prednosti, ki jih imajo mRNA terapevtik, je široka možnost njihove uporabe (npr.; za celično reprogramiranje, imunoterapija raka ter urejanje genoma). Vendar po ima uporaba mRNA določene omejitve zaradi nizke kemične stabilnosti molekule in njene enostavne razgradljivosti, kar vodi do krajšega obstoja molekule v celici in zmanjšanju nivoja proteinov ter posledično do zmanjšane učinkovitosti. Obstaja več strategij, s katerimi je možno podaljšati stabilnost mRNA, kot so optimizacija kodona, kemijske modifikacije (npr. nukleozidna substitucija), uporaba krožne RNA ter uporaba samo-pomnoževalne RNA tehnologije. Vendar ima vsaka od strategiji svoje pomanjkljivosti in omejitev, zato so potrebne alternativne strategije za izboljšanje stabilnosti mRNA, ki bi omogočile razširitev uporabe mRNA terapevtikov. 3' neprevedena regija (UTR) vsebuje številne regulatorne elemente, ki imajo ključno vlogo pri kontroli izražanja genov, tako da uravnavajo stabilnost mRNA in učinkovitost translacije. Do sedaj uporabljeni 3' UTR-ji niso uspeli dovolj povečati stabilnosti molekul mRNA, da bi zadostili zahtevam različnih aplikacij. Odkritje novih, učinkovitejših 3' UTR-jev bi pomembno prispevalo k razvoju mRNA terapevtikov.

Rezultati

V predhodno izvedeni študiji, kjer je bila izvedena sistematična kvantifikacija regulatornih efektov 27 tisoč človeških 3' UTR fragmentov, so raziskovalci odkrili pri mRNA za protein ARF6 160 nukleotidov dolg 3'UTR, ki je imel večjo sposobnost povečanja ravni izražanja genoa v primerjavi z do zdaj najbolj splošno uporabljenim 3′ UTR iz mRNA za globin. V tej študiji so na začetku potrdili povečane ravni izražanja reporterskega gena za protein EGFP s 3′ UTR-jem iz ARF pri treh različnih celičnih linijah. S razdelitvijo 160 nukleotidov dolge regije na prekrivajoče se segmente, določitvijo sposobnosti povečanja izražanja genov posameznega segmenta ter krajšanjem izbranega segmenta so identificirali 40 nukleotidov dolgo regijo (ARF6.40), ki je odgovorna za povečano stabilnost mRNA molekule in določili, da ta prestavlja osrednjo funkcionalno regijo.

S pregledom nukleotidnega zaporedja ARF6.40, so raziskovalci odkrili dve s CU bogati ponovitvi (CURE). Uvedba mutacij v te ponovitvi je vodila k znižanju ekspresije, izbris pa v izgubo sposobnosti povečanja ekspresije reporterskega gena, kar nakazuje, da CURE predstavljale funkcionalni element, ki je potreben da ARF6.40 ohrani svoje sposobnosti izboljšanja ekspresije. Pri primerjavi 3' UTR mRNA ARF6 različnih vrst sesalcev so odkrili, da sta prisotna CURE izredno evolucijsko ohranjena. Raziskovalci so to regijo za poimenovali nCURE (the novel CURE). Pri primerjavi ARF6.40 in 3' UTR globina, ki se pogosto uporablja v mRNA cepivih za povečanje izražanja genov, je bil pri ARF6.40 nivo mRNA za EGFP ter tudi nivo proteina EGFP višji kot pri 3' UTR globina. Nivo izločenih receptor vezavnih domen (RBD) v supernatant po transvekciji s LNP-mRNA je bil pri uporabi ARF6.40 ves čas (8, 12, 48 ur po transfekciji) višji kot pri uporabi 3' UTR globina. Pridobljeni podatki nakazuje, da ima ARF.40 boljšo sposobnost povečanja izražanja eksogene mRNA v celicah kot jo ima 3' UTR globina.

Z uporabo uporabo računalniškega orodja RBPmap so našli pet proteinov, s potencialom za vezavo na nCURE. V celicah so zbili posamične gene za vsakega od teh proteinov. Znižanje ekspresije so opazili samo pri proteinu U2AF2, enake rezultate so dobili s istim poskusom na drugi celični liniji. Z uporabo RNA imunoprecipitacije in kvantitativnim PCR v realnem času (RIP-qPCR) so prišli do ugotovitve, da je U2AF2 tisti protein, ki se veže na nCURE. S določanjem količine razpada mRNA v celici so opazili, da je mRNA s ARF6.40 imela daljšo razpolovno dobo kot mRNA s 3' UTR globina. Rezultati nakazujejo na sposobnost ARF6.40 za povečanje stabilnosti mRNA ter da je povečana stabilnost mRNA je posredovana z vezavo U2AF2 na nCURE.

Za ocenitev uporabe ARF6.40 za izboljšanje učinkovitosti mRNA terapevtikov so v miši inicirali mRNA, za zapisom za kresničkino luciferazo (FLuc) in ARF6.40 ali 3' UTR globina. Ta je bila enkapsulirana v lipidnihe nanodelce inicirana intravensko. 5 ur po iniciranju je bila prisotna ekspresija FLuc, vendar ni bilo statistične razlike med obema skupinama miši. Opazna razlika je bila prisotna 10 ur po iniciranju. Takrat je bila količina FLuc večja pri mišjih s LNP-mRNA, ki so vsebovale ARF6.40. Ti rezultati so pokazali, da ARF6.40 lahko izboljša izražanje eksogene mRNA in vivo.

Razprava

3′ UTR-ji so funkcionalno raznoliki in kompleksni, saj se med seboj razlikujejo po dolžini in nukleotidnem zaporedju. Glede na cis-regulatorne elemente, ki jih vsebujejo, lahko bodisi zmanjšujejo bodisi povečujejo stabilnost mRNA in učinkovitost translacije. Razumevanje funkcionalnih elementov v človeškem genomu je eden temeljnih ciljev sodobne medicine, biologije in sorodnih ved. Ti elementi nam omogočajo vpogled v kako natančno in dinamično uravnavane so genske regulacijske mreže. Po drugi strani pa jih lahko uporabimo za gradnjo sintetičnih genomov v okviru sintezne biologije ter za načrtovanje terapevtskih mRNA za zdravila. Ko že večkrat omenjeno ARF6.40 izvira iz gena ARF6, ki kodira majhno GTP-azo iz družine Ras. ARF6 je vključeno v uravnavanje celične signalizacije in dinamike celične membrane in je ključnega pomena za celično proliferacijo, invazijo in metastaziranje. Prekomerna ekspresija ARF6 je povezana z več agresivnimi raki. Klinično so visoke ravni ARF6 in njegovo sodelovanje z več onkogeni, povezani s slabšim celokupnim preživetjem pri različnih rakih. Vendar pa še vedno ni povsem jasno, kaj vzdržuje visoko ekspresijo ARF6 v rakavih celicah.

Izboljšana stabilnost mRNA in učinkovitost translacije je koristna za razvoj mRNA terapevtikov. Z uporabo BTV poročevalskega sistema so v študiji dokazali, da vključitev fragmenta ARF6.40 v 3′ UTR izrazito poveča produkcijo reporterskega proteina v več različnih celičnih linijah. Nadaljnji testi izločanja z mRNA za RBD SARS-CoV-2, so pokazali, da ARF6.40 vodi do bistveno višjega in dolgotrajnejšega izločanja proteina RBD v primerjavi s pogosto uporabljenim 3′ UTR globina. In vivo aplikacija mRNA za kresničkino luciferazo, enkapsulirane v lipidne nanodelce in združene z ARF6.40, pri miših povzročila izrazito in dolgotrajno povečanje izražanja luciferaze, kar poudarja njegov močan potencial za izboljšanje biološke razpoložljivosti proteinov v terapevtskem kontekstu dostave. Te ugotovitve izpostavljajo velik potencial ARF6.40 za široko uporabo v mRNA terapevtikih, vključno z genskimi terapijami, cepivi proti nalezljivim boleznim in zdravljenjem raka. Dodatna dobra lastnost pri mRNA je, da je regulacijska aktivnost RNA-elementov lahko specifična glede na tip celic.

Odkritje, da nCURE v 3′ UTR posreduje izrazito povečano izražanje gena prek specifične interakcije z RNA-vezavnim proteinom U2AF2, ponuja nove vpoglede v njegov regulacijski mehanizem in odpira nove smeri za raziskovanje regulacijske mreže gena ARF6. Znano je dejstvo, da ima U2AF2 ključno vlogo pri izrezovanje intronov, saj prepoznava signale polipirimidinskega trakta v nastajajočih transkriptih, pri čemer preferenčno veže na RNA z veliko uracila. Ta ugotovitev skupaj z pridobljenimi podatki kaže na dvojno regulativno vlogo U2AF2 pri pri izrezovanje intronov in uravnavanju stabilnosti mRNA.

Za boljše razumevanje, kako U2AF2 stabilizira mRNA preko interakcijo, so potrebne nadaljnje raziskave. Razumevanje, kako interakcije nCURE–U2AF2 uravnavajo izražanje ARF6, bi lahko razkrilo nove terapevtske tarče pri rakih, kjer ima ARF6 ključno onkogeno vlogo, ter potencialno vodilo k razvoju strategij za uravnavanje njegove ravni v terapevtske namene. Kljub pridobljenim informacijam bi dodatne raziskave, zagotovile dodatne informacije o aplikativnem potencialu ARF6.40.

Metode

Za določitev nivoja proteinov so uporabili poročevalski test, pri katerem sta s dvosmernim tetraciklinskim promotorjem (BTV) regulirana kontroli gen (gen za LNGFR) in poročevalski gen (gen za EGFP). Promotor je aktiviran s tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA), ki se ob dodatku doksicikilina veže na DNA in onemogoči trasnkripcijo genov. Celice so nato analizirali s ločevalnikom fluorescenčno označenih celic (FACS). LNGFR je bil označen s protitelesi, konjugiranimi z barvilom APC. Količino mRNA so določili s RTq-PCR. Pri preverjanju izražanja eksogene mRNA v celicah so naredili transfekcijo celic z lentavirusi, ki so vsebovali in vitro sintetiziran SARS-CoV-2 RBD mRNA z AFF6.40 ali 3' UTR globina. Koncentracije RBD so bile kvantificirane z uporabo komercialnega kompleta. Ustvarili so usmerjevalne RNA, ki ciljajo gene za proteine z potencialno možnostjo vezave na nCURE. Ta zaporedja so bila klonirana v lentiCRISPRv2, ki je bil zasnovan na osnovi CRISPR-Cas9 sistema. Celice so transficirali s pridobljenimi lentivirusi in preverili učinkovitost izbitja posamičnega gena. Nato je bil v modificirane celice vnesen poročevalsi BTV sistem, ki je vseboval ARF6.40. In vitro ekspesija LPN-mRNA je bila analizirana iz podatkov o bioiluminiscenci (BLI).

Viri

J. Tang, M. Li, B. Liu, C. Wu, F. Dai, H. Kang, K. He, W. Zhao, Incorporation of a Human-Derived CU-Rich Element in the 3′ UTR Improves Synthetic mRNA Stability and Expression In Vivo, ACS Synth. Biol. 15(3) (2026) 993–1000. https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00824