Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih

Karotenoidi so hidrofobni organski pigmenti, ki se v naravi lahko sintetizirajo v rastlinah, algah, glivah in bakterijah. Njihov osrednji del predstavlja polienska veriga z 9 konjugiranimi dvojnimi vezmi, zaradi katerih so karotenoidi zmožni absorbirati svetlobo v vidnem spektru, kar jim daje značilno obarvanost¹.

Karotenoidi v rastlinah

Pri rastlinah karotenoidi igrajo pomembno vlogo, saj sodelujejo pri absorbciji svetlobe za fotosintezo, učinkujejo antioksidativno in fotoprotekcijsko ter promovirajo rast rastlin². Zato je za normalen razvoj rastlin pomemben tudi encim ζ-karoten desaturaza (ZDS), ki sodeluje v biosintezni poti karotenoidov, in sicer pri pretvorbi ζ-karotena v likopen³.

Avtorji članka⁴ so preučevali kakšen je učinek utišanja tega encima v gensko spremenjenih paradižnikih.

Izvedba eksperimenta

Za utišanje ZDS so uporabili metodo interferenčne RNA. To so izvedli tako, da so z metodo Gateaway kloniranja⁵ v regijo T-DNA binarnega vektorja pK7GWIWG2(I) vstavili zapis za smerno in protismerno zaporedje za ZDS. Zaporedji sta se nahajali pod promotorjem virusa mozaika cvetače in med njima je bil še intron⁴. Ta zapis se je tako znotraj rastlinske celice prepisal v lasnično RNA, iz katere so nastale kratke interferirajoče RNA (siRNAs), ki so se vezale na mRNA ζ-karoten desaturaze in povzročile njeno cepitev ter posledično utišanje tega encima⁶.

Transformacijo kličnih listov paradižnika so izvedli z bakterijami Agrobacterium tumefaciens. Po dvodnevni kokultivaciji kličnih listov paradižnika z bakterijami, ki so vsebovale binarni in razoroženi vektor, so klične liste prenesli v regeneracijski medij. Nastale poganjke so nato odrezali in prenesli v nov medij, v katerem so rastline razvile korenine, tako da so jih nato lahko prenesli v lončke z zemljo in gojili pri 25°C. Za kvantitativno okarakterizacijo so uporabili liste in plodove paradižnika v treh stopnjah dozorelosti: nedozorel (angl. mature green), srednje dozorel (angl. breaker) in povsem dozorel (angl. ripe)⁴.

Za določevanje nivoja izražanja posameznih genov v biosintezni poti karotenoidov je bil po izolaciji RNA in reverzni transkripciji v cDNA uporabljen qPCR, pri katerem je endogeno kontrolo predstavljal gen za β-aktin. Vsebnost posameznih karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov je bila po ekstrakciji določena s HPLC⁴.

Rezultati

Uspešnost utišanja ζ-karoten desaturaze in morfološke spremembe pri transformiranih paradižnikih

Po transformaciji so pri vseh dvanajstih uspešno transformiranih paradižnikih ugotovili nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo, ki je bila transformirana s praznim vektorjem. Za nadaljno analizo sta bili nato izbrani dve z RNA interferenco spremenjeni liniji (liniji RI), ki sta imeli za več kot 75% nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo⁴.

Poleg razlik v velikosti rastlin, kjer sta liniji RI zrastli za 2,4-krat višje kot kontrolna linija, so se morfološke razlike pokazale tudi na listih in plodovih paradižnika. Liniji RI sta imeli v primerjavi s kontrolo večje liste, ki so imeli bele lise, in večje plodove, ki so bili prav tako bele barve. To je posledica spremenjene vsebnosti karotenoidov in flavonoidov v listih in plodovih⁴.

Spremembe v izražanju genov v biosintezni poti karotenoidov in spremembe v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov

Kot je bilo pričakovano, je bila ekspresija gena za ZDS v linijah RI nižja v vseh treh stopnjah zorenja paradižnika v primerjavi s kontrolo. Prav tako se je v linijah RI v primerjavi s kontrolo pokazala nižja ekspresija genov za fitoen desaturazo (PDS) in fitoen sintazo (PSY), čeprav je bila eskpresija slednjega v nedozoreli stopnji višja kot v kontrolni liniji. Izražanje gena za likopen β-ciklazo (LYCB) v linijah RI je bilo v vseh treh stopnjah zorenja višje v primerjavi s kontrolo⁴.

Plodovi linij RI so vsebovali višji delež fitoena v primerjavi s plodovi kontrole, medtem ko se je vsebnost likopena in β-karotena v plodovih linij RI znižala pod mejo detekcije. Prav tako se je v listih in plodovih linij RI znižala vsebnost ksantofilov, klorofilov in flavonoidov v primerjavi z listi in plodovi kontrolne linije. Pri analizi vsebnosti fitohormonov je bilo ugotovljeno, da se je delež giberelinske kisline v linijah RI znatno povečal v primerjavi s kontrolo, medtem ko se je vsebnost abscizinske kisline znižala⁴.

Zaključek

Avtorji članka so z metodo interferenčne RNA uspešno utišali gen za ζ-karoten desaturazo (ZDS) v paradižniku. Rezultati eksperimentov so pokazali, da ima ZDS pomembno vlogo pri razvoju paradižnikov in da utišanje tega gena povzroči različne morfološke spremembe, ki so posledica sprememb v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov v gensko spremenjenih linijah. S to študijo je bilo dokazano, da ZDS predstavlja eno izmed osrednjih kontrolnih točk v biosintezni poti karotenoidov in da bi se lahko s spremenjenim izražanjem tega gena povečala vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih rastlinah, kar je eden izmed ciljev živilske industrije⁴.

Literatura

1. Barreiro, C. & Barredo, J. L. Carotenoids production: A healthy and profitable industry. Methods in Molecular Biology 1852, 45–55 (Humana Press Inc., 2018).

2. Kim, H. S. et al. Orange: a target gene for regulating carotenoid homeostasis and increasing plant tolerance to environmental stress in marginal lands. J. Exp. Bot. 69, 3393–3400 (2018).

3. Galpaz, N., Ronen, G., Khalfa, Z., Zamir, D. & Hirschberg, J. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white-flower locus. Plant Cell 18, 1947–1960 (2006).

4. Babu, M. A., Srinivasan, R., Subramanian, P. & Kodiveri Muthukaliannan, G. RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content. Plant Growth Regul. 93, 189–201 (2021).

5. Karimi, M., Depicker, A. & Hilson, P. Update on Recombinational Cloning with Plant Gateway Vectors. Plant Physiol. 145, 1144–1154 (2007).

6. Liu, Q., Hurlstone, C., Singh, S. & Green, A. Application of hpRNA-Mediated Gene Silencing Techniques to Modification of Fatty Acid Composition. Advanced Research on Plant Lipids 407–410 (Springer Netherlands, 2003). doi:10.1007/978-94-017-0159-4_95