Vpliv valina in drugih aminokislin na vsebnost diacetila in 2,3-pentadiona v pivini

Med fermentacijo alkoholnih pijač se iz prekurzorjev valina, levcina in izolevcina tvorijo vicinalni diketoni (VDK), kot sta diacetil in 2,3-pentadion. Te dajejo pivu maslen oz. karamelast okus, kar je pri lager stilih piva neželjeno, saj pri lagerjih težimo k čistim profilom okusa. Eden od obetavnejših pristopov za zmanjševanje produkcije diacetila je preko kontrole vsebnosti valina v pivini, saj je le ta pomemben za povratno inhibicijo encimov, ki sodelujejo v produkciji prekurzorjev diacetila. Mejna vrednost diacetila pri lagerjih je 0,1 – 0,2 mg/L, medtem ko je ta vrednost pri ale pivih 0,1 - 0,4 mg/L. Najnižje znane vrednosti diacetila se vrtijo okoli 15 μg/L. Diacetil in 2,3-pentadion nastajajo zunaj celic, torej v fermentacijski brozgi z spontano neencimsko oksidativno dekarboksilacijo α-acetohidroksi kislin, ki so intermediati pri biosinteznih poteh valina, izolevcina in levcina.

Znotraj celice se sinteza valina začne z pretvorbo piruvata do α-acetolaktata, ki se preko treh korakov pretvori do valina. Hitrost sinteze določa najpočasnejša reakcija, to je pretvorba α-acetolaktata do 2,3-dihidroksi-izovalerata. Med fermentacijo se zato dogaja, da α-acetolaktat uhaja čez celično membrano v pivino, kjer se neencimsko pretvori v diacetil. Kvasovke so zmožne pretvorbe/redukcije diacetila in 2,3-pentadiona v acetoin, 2,3-butanediol in 2,3-pentanediol. Slednji imajo višji prag zaznavnosti okusa, zato redko vplivajo na senzorične lastnosti piva. Ta redukcija se ponavadi začne že med primarno fermentacijo, vendar ob koncu koncentracije VDK vseeno presegajo mejne vrednosti. Zato je pri lagerjih potreben dodaten korak zorenja, kjer nivoji VDK padejo pod mejne vrednosti. Znižanje vsebnosti diacetila je torej glavni namen zorenja piva. Staranje je pogosto drag in dolgotrajen postopek, zato je pivovarnam v interesu, da se odkrije način, kako znižati vsebnost diacetila, brez da bi s tem vplivali na sestavo in kvaliteto piva. Valin s povratno zanko inhibira encim acetohidroksiacil sintazo (AHAC), ki katalizira ireverzibilno pretvorbo piruvata do α-acetolaktata, in pretvorbo α-ketobutirata do α-acetohidroksibutirata in je ključen za tvorbo VDK. Negativno povratno zvezo lahko torej dosežemo z povečano koncentracijo valina v gojišču oz. z povečanim privzemom valina v celico. Koncentracija ostalih aminokislin, še posebej razvejanih, lahko posredno prek vpliva na privzem valina iz okolja v celico vpliva na produkcijo diacetila.

V raziskavi so si zamislili naslednje tri poskuse: - V prvem so testerali produkcijo diacetila in 2,3-pentadiona v gojiščih z različnimi dodatki valina (100, 200 in 300 mg/L). - V drugem so testerali dodatek valina (300 mg/L) k (a) gojišču s standardnimi koncentracijami aminokislin in (b) gojišču s polovično vsebnostjo aminokislin. - V tretjem so testirali dodajanje različnih skupin aminokislin v gojišče (koncentracije do 200% standardne).

REZULTATI

Dodajanje različnih količin valina v pivino:

Vsi dodatki valina (100-300) so znižali maksimalno in končno koncentracijo diacetila, niso pa imeli velikega vpliva na koncentracijo 2,3-pentadiona. Koncentracija diacetila ob koncu fermentacij nikjer ni padla pod zaznavno mejo (100 μg/L), vendar pa se je koncentracija diacetila v pivini z dodatkom 300mg/L valina tej meji približala (okoli 120 μg/L).

Dodajanje valina v pivini s standardno in reducirano vsebnostjo aminokislin:

Biomasa je bila v pivini z normalnim aminokislinskim profilom za 20% večja kot pri reduciranem, pH reduciranega gojišča je bil cel čas fermentacije nižji. Dodatek valina je tudi v tem primeru znižal maksimalno in končno vsebnost diacetila, ni pa bistveno vplival na količino 2,3-pentadiona. Koncentracija diacetila nikjer ni padla pod zaznavno mejo, le te pa se je najbolj približala pivina s polovično vsebnostjo a.k. in dodatkom 300mg/L valina. Privzem valina je bil prve tri dni večji v pivini z dodanim valinom kot pri kontroli, dodatek valina pa ni vplival na privzem izolevcina in levcina. Iz vseh primerov je očitna negativna korelacija med koncentracijo diacetila in privzemom valina.

Dodajanje različnih skupin aminokislin v pivino:

Po dodatkih so izmerili majhno spremembo v pH pivine, ki je posledica narave dodanih aminokislin. Dodatek preferenčnih (PAA) in nepreferenčnih a.k. (NPAA) je povzročil povečano koncentracijo diacetila med fermentacijo, prav tako je dodatek BCAA povzročil začetno povečanje diacetila (do 50h), v nadalnjem pa se je koncentracija diacetila zmanjšala glede na kontrolo. Koncentracija diacetila so bile ob koncu fermentacije je bila najnižja za pivino z dodanimi razvejanimi a.k. (BCAA), medtem ko je bila koncentracija diacetila za pivini z dodanimi NPAA in PAA relativno višja. Dodatek NPAA in BCAA je povzročil zmanjšanje relativne vsebnosti 2,3-pentadiona, dodatek PAA pa je njegovo vsebnost povišal.

ZAKLJUČEK

Namen te raziskave je bil ugotoviti, kako vpliva dodatek valina v pivino in spreminjanje aminokislinskega profila na vsebnost vicinalnih diketonov v pivini. Ugotovili so, da dodatek valina zmanjša tako maksimalno kot tudi končno količino diacetila v pivini, kar bi lahko pivovarnam skrajšalo čas zorenja lager piva in jim zmanjšalo stroške. Zmanjšana koncentracija diacetila je posledica večjega privzema valina v celico, ki inhibira AHAS, posledično pa se proizvaja manj α-acetolaktata. Podobno kot valin pa vplivata še izolevcin in levcin (skupina BCAA). Količino diacetila v pivini bi lahko torej zmanjšali z modifikacijo aminokislinskega spektra preko dodatkov ali preko spreminjanja pogojev sušenja ali slajenja.

POVZETO PO

K. Krogerus, BR. Gibson. Influence of valine and other amino acids on total diacetyl and 2,3-pentanedione levels during fermentation of brewer's wort. Appl. Microbiol Biotechnol., Aug., 2013.