View source for Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil

'''Uvod'''

Organofosfati ali fosfatni estri so organske molekule in mnoge izmed njih so ključnega pomena za naše življenje (DNA, RNA, kofaktorji) [1]. V biotehnologiji, zdravstvu in agrikulturi se izraz organofosfati nanaša na skupino insekticidov, ki delujejo na encim acetil-holinesterazo. Omenjeni encim ima ključno vlogo pri prenosu signalov v živčnem sistemu insektov, ljudi in mnogih drugih živali. Organofosfatni pesticidi, kot sta na primer paration in metil paration (MP), ireverzibilno inaktivirajo acetil-holinesterazo in so zato učinkoviti pesticidi [1]. V primerjavi z organokloridi se v naravi hitreje razgradijo in so zato manj nevarni za človeka, vseeno pa lahko povzročijo hujše bolezni. Zato se je pojavila potreba po razvoju bioremediacijskega sistema za razgradnjo organofosfatov v okolju, kjer uporabljajo omenjene insekticide.


=='''Ideja in cilji raziskave'''==

Imobilizacija encimov ima mnoge prednosti pred uporabo topnih encimov in ima zato velik interes v industriji. Poleg tega je bioremediacija vse pomembnejša tema okoljevarstvenikov, zato so se v raziskavi osredotočili na imobilizacijo encima OpdA (Organophosphate degrading enzyme A), imenovanega tudi fosfotriesteraza ali organofosforna hidrolaza (iz bakterije ''Pseudomonas diminuta''). Omenjeni encim ima široko substratno specifičnost; cepi lahko vezi P-O, P-CN in P-F v mnogih organofosfatnih spojinah. Katalizira tudi pretvorbo toksičnega metil parationa (MP) v manj toksičen p-nitrofenol (pNP), ki absorbira, zato je primeren za uporabo v raziskavah [2][3]. V raziskavi so preverili, kako vezava encima na poliestrska vlakna vpliva na njegove kinetične lastnosti, stabilnost in ponovno uporabnost.


=='''Potek raziskave in rezultati'''==

Imobilizacijski proces je vseboval tri stopnje. V prvi fazi so poliestrska vlakna tretirali z 99% EDA. Ena od aminskih skupin EDA-ja je reagirala s poliestrskim vlaknom, druga aminska skupina pa je ostala prosta. V drugem koraku so uporabili povezovalno molekulo glutaraldehid, ki se je vezal na prosto aminsko skupino EDA-ja. V zadnji stopnji so dodali očiščen encim OpdA, ki se je z N-koncem vezal na glutaraldehid. 

Po pripravi imobiliziranega encima so opravili kinetične meritve, pri čemer so opazovali različne parametre. Pričakovano se je povečala Km encima (za substrat MP) in sicer za 2x v primerjavi s topnim encimom. Glede na povprečno povečanje konstante pri imobilizaciji encimov (3-6x) lahko rečemo, da je bila imobilizacija zelo uspešna. Ugotovili so tudi, da lahko imobiliziran encim OpdA v primerjavi s topnim encimom deluje v precej širšem pH območju, saj je topen encim praktično neaktiven že pri pH-jih manjših od 6,5, medtem ko imobiliziran encim še pri pH=5 ohrani polovico svoje aktivnosti. Imobiliziran encim je prav tako termostabilnejši in tudi po večurni inkubaciji pri 55 °C ohrani praktično celotno aktivnost. Testirali so tudi različne pogoje shranjevanja imobiliziranega encima in ugotovili, da je najustreznejše shranjevanje pri 4 °C v suhi obliki ali v puferski raztopini. µ

Sledilo je testiranje učinkovitosti pripravljenega imobiliziranega encima pri razgradnji metil parationa. Dokazali so, da ob ustrezni količini poliestrskih vlaken z encimom razpade praktično ves MP že pri 30-60 minutah. Ugotovili so, da encim po večkratni uporabi delno izgubi svojo aktivnost in potrebuje več časa, da razgradi enako količino MP-ja. To pripisujejo encimski nestabilnosti in njegovi proteolizi. Pripravili so tudi kolone z enakim poliestrskim nosilcem, na katerega so vezali OpdA in ugotovili, da se pri nižjih pretokih razgradi praktično ves metil paration. V primeru velikega pretoka in nanosa večje količine raztopine MP-ja na kolono, pa ne pride do popolne razgradnje MP-ja. Encim v kolonah je precej obstojen približno 2 meseca, nato pa naj bi izgubljal zmožnost degradacije organofosfatov. 

Preverili so tudi razgradnjo kumafosa, ki se prav tako uvršča med organofosfatne insekticide. Ugotovili so, da lahko pripravljen sistem uporabijo tudi za razgrajevanje omenjenega organofosfata, precej verjetno pa tudi za ostale organofosfatne insekticide.


=='''Zaključek'''==

V okviru raziskave so znanstveniki pokazali, da je netkan poliestrski tekstil (oz. poliestrska vlakna) ustrezen nosilec za bioremediacijske encime, ki razgrajujejo organofosfate. Imobiliziran encim kaže povišano stabilnost in nizko izgubo aktivnosti v primerjavi s topnim encimom. Prav tako izkazuje sposobnost razgradnje organofosfatnih pesticidov že pri nizkih koncentracijah organofosfatov, uporablja pa se lahko v kontinuirnih ali ne-kontinuirnih procesih.


=='''Literatura'''==

Izhodiščni članek: Y. Gao, Y. B. Truong, P. Cacioli, P. Butler, in I. L. Kyratzis, „Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles“, Enzyme Microb. Technol., let. 54, str. 38–44, jan. 2014.

[1] „Organophosphate“, Wikipedia, the free encyclopedia. 25-mar-2015.

[2] F. M. Raushel, „Bacterial detoxification of organophosphate nerve agents“, Curr. Opin. Microbiol., let. 5, št. 3, str. 288–295, jun. 2002.

[3] K. Lai, N. J. Stolowich, in J. R. Wild, „Characterization of P-S Bond Hydrolysis in Organophosphorothioate Pesticides by Organophosphorus Hydrolase“, Arch. Biochem. Biophys., let. 318, št. 1, str. 59–64, maj 1995.