View source for Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum

==Namen== 
Karotenoidi so naravni pigmenti z barvnim spektrom od rumene do rdeče. Spadajo v skupino terpenoidov in imajo, poleg pomembne vloge v organizmu, ki jih proizvaja, tudi pozitivne učinke na človekovo zdravje. Posebej so zanimivi prehrambeni industriji za barvanje pijač in hrane ter kot dodatek v obliki vitaminov (Downham in Collins, 2000; Gassel et al., 2013). Letno jih proizvedejo nekaj tisoč ton zato je biološka in okolju prijazna produkcija še posebej zanimiva. Ena izmed metod za povečano mikrobno produkcijo je optimizacija sinteznih poti za prekursorje in prekomerno izražanje genov te sintezne poti. 
==Karotenoidi==
Karotenoidi so naravni pigmenti, ki so prisotni v kloroplastih rastlin in nekaterih drugih bakterij in gljiv. Razdeljeni so v dve osnovni skupini, ksantofili in karoteni. Prvi vsebujejo v molekuli strukturni kisik, drugi so čisti ogljikovodiki. Karotenoidi so tetraterpenoidi saj se v biosintetski poti sintetizirajo iz osmih izoprenskih enot in so na koncu sestavljeni iz 40 ogljikovih atomov. V rastlinah in algah imajo poglavitno vlogo absorpcije svetlobe v fotosintetskih proteinih in zaščite klorofila pred svetlobno razgradnjo. Sinteza v organizmih poteka iz dveh osnovnih molekul, IPP in njegovega izomera DMAPP, ki pa se sintetizirata po dveh različnih poteh: mevalonatni (MVA), ki kot vir ogljikove verige uporablja acetil-CoA in jo uporabljajo evkarionti, ter 2-metileritritol 4-fosfatni (MEP) poti, ki kot precursor IPP in DMAPP porablja gliceraldehid-3-fosfat in piruvat.  
Raziskave so pokazale, da so ljudje, ki zaužijejo velike količine naravnih terpenoidov iz sadja in zelenjave, bolj zdravi in imajo izkazujejo manjšo umrljivost zaradi kroničnih bolezni (A. T. Diplock in J. L. Charleux, 1998). Prav tako imajo ljudje, ki zaužijejo velike količine β-karotena statististično manjše možnosti za raka debelega črevesa in pljučnega raka ( Miller in Sinder, 2012). 
Poti sinteze karotenoidov so še posebej zanimive s stališča razvoja novih antibiotokov. Sesalci genov za sintezo karotenoidov po MEP poti nimamjo, zato bi lahko bile inhibotrske molekule MEP poti učinkoviti antibiotiki. Fosmidomycin je antibiotik, ki je strukturni analog prehodnega stanja 2-metileritritol-4-fosfata in inhibira encim DXP reduktoizomerazo, ki je ključen v sintezni poti izoprenoidov po ne mevalonatni poti (MEP). 
==Konstrukcija seva in optimizacija sinteznih poti== 
MEP pot sinteze prekursorjev karotenoidov je sestavljena iz devet reakcij, ki jih katalizira osem encimov. Sinteza se začne s prenosom acetaldehidne skupine s piruvata na gliceraldehid-3-fosfat, ki ga katalizira DXP sintaza. Produkt reakcije je DXP (1-deoksi-D-ksiluloza-5-fosfat). DXP je prav tako prekursorska molekula v sintezi tiamina (vitamin B1) in piridoksina (vitamin B6). Encim DXP reduktoizomeraza zato pretvori DXP v MEP (NADH kot kofaktor), ki pa se nato v trostopenski reakciji s cikličnim intermediatom pretvori v IPP in njegov izomer DMAPP s pomočjo dveh železo-žveplovih proteinov IspG in IspH (Rohdich in sod., 2004). IPP in DMAPP se ne sintetizirata v enakem razmerju, zato je potrebna IPP:DMAPP-izomeraza, ki omogoča olajšano izomerizacija IPP v DMAPP. 
Corinebacterium glutamicum je gram-pozitivna, močno obarvana bakterija, ki jo že vrsto let uporabljajo v prehrambeni industriji za fermentativno proizvodnjo aminokislin kot sta glutamat in lizin. Letno se s pomočjo C. glutamicum proizvede približno 1,95 milijona ton lizina (Ajinomoto, 2014). Poleg aminokislin pa s spomočjo C. glutamicum proizvejajo tudi industrijsko in sintetzno pomembna diamina kadaverin in putrescin ter alkohola etanol in izobutanol. V zadnjih letih pa so se z odkritjem in karakterizacijo genov za sintezo C40 in C50 karotenoidov odple nove možnosti za biosintezno proizvodnjo prekursorjev, vitaminov in barvil (Heider in sod., 2014).
Za produkcijo karotenoidov so karakterizirali dve reakciji, ki predstavljata »ozko grlo« sinteze končnih produktov. Prvo je encim DXP sintaza, ki katalizira prvo stopnjo v kaskadi sinteze IPP in DMAPP (Springer in sod., 1997) ter prekomerno izražanje encima Idi, ki pa sicer ni esencialni ecim v MEP poti produkcije karotenoidov (Hahn in sod., 1999). 
V raziskavi so avtorji skonstruirali dva sintetična operona (ispDFE in dxr-ispGH) pod kontrolo močnega promotorja Ptuf elongacijskega faktorja EF-Tu bakterije C. glutamicum. Operon 1 (Op1) je bil konstruiran z namen, da poveča izražanje ispDF, operon 2 (Op2) pa je predstavljal fuzijo genov za dxs, ispG in ispH pod kontrolo Ptuf promotorja in RBS. Prav tako so z menjavo promotorja gena dxs (DXS sintaza) povzročili prekomerno izražanje produkta tega gena. Prekomerno izražanje idi gena so dosegli z IPTG inducibilnim plazmidom. Sev, ki je prekomerno izražal vseh osem proteinov MEP poti se je izkazal primeren za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in nekaterih astaksantinov.     

==Materiali in metode==
Corinebacterium glutamicum, sev ATCC13032 je bil uporabljen kot vir genov, operonov in promotorjev. Za metabolno inžinirstvo je bil uporabljen sev C. glutamicum MB001, ki ima izbrisane ostanke fagnih genov (Baumgart is sod., 2013). Gojili so jih v osnevnem LB mediju z glukozo pri 30 °C. 
Plazmidi so bili skonstruirani in pomnoženi v E.coli DH5α s PCR generiranimi fragmenti, stanndardne reakcije restrikcije in ligacije so bile izvedene po Gibsonovi metodi ( Gibson in sod., 2001). Transformacije so bile izvedene z elektroporacijo pri 2,5 kV (Van der Rest in sod., 1999). 
Delecije genov so bile izvedene s samomorilskimi plazmidi pK19mobsacB in njegovimi konstrukti (Schafer in sod., 1994). PCR konstrukti so bili očiščeni in povezani s crossover PCR in vstavljeni v vektor (pK19mobsacB-δcrtYEb). Delecije so bile izvedene z metodo dvojne homologne rekombinacije in selekcije v vsakem koraku (Eggling., 2005). Na enak način so zamenjali tudi promotorsko regijo dxs gena in jo nadomestili s promotorsko regijo tuf gena.
Ekstrakcijo karotenoidov iz peleta bakterijskih celic so naredili z mešanico metanola in acetona ( 7:3). Koncentracijo so izmerili spektrofotometrično pri 470 nm, karakterizacijo posameznih karetenoidov pa s HPLC analizo. Aktivnost DXS encima so izmerili posredno z meritvijo koncentracije preostalega piruvata v reakcijski mešanici z encimom piruvat- dehidrogenaza in merjenjem absorbcije NADH, ki se med reakcijo porablja. 
== Rezultati== 
Prekomerno izražanje DXS (LYC-Ptuf) je izboljšalo donos likopena na gram suhe celične mase. Sev LYC3 (divji tip) je proizvajal v povprečju 0,04 mg/g, LYC3-Ptufdxs pa 0,08 mg/g suhe celične mase. V primeru dodanih sintetičnih operonov, ki so ju inkorporirali v kromosome, pa se je produkcija likopena povečala na 0,1 mg/g suhe celične mase le v primeru vstavljenih obeh (Op1 in Op2) operonov hkrati (LYC-Op1Op2). Celice vseh tipov (LYC-Ptuf,, LYC-Op1Op2)  pa so rastle počasneje kot divji tip LYC3. To je najverjetneje rezultat velike porabe vira ogljika za produkcijo IPP. V ta namen so kot vir ogljika preizkusili tudi glycerol, ker pa celice glicerola kot samostojnega vira ogljika ne morejo uporabljati so bakterije transformirali s plazmidom pVWEx1-glpFKD, ki je imel zapis za encim, ki pretvarja glycerol v gliceraldehid-3-fosfat. Rast bakterij je bila kljub vključitvi plazmida še zmeraj zmanjšana, količina produciranega likopena pa se je podvojila. Predpostavljajo tudi, da je rast zmanjšana zaradi ne optimalnega razmerja med IPP in DMAPP. Sevi so prav tako proizvajali večje količine ostalih karotenoidov kot je β-katoreten, zeaksantin in astaksantin. 
==Zaljuček== 
Pripravljeni so bili rekombinantni sevi bakterije C. glutamicum, ki lahko proizvajajo različne derivate likopena in terpenoide. Z enžiniringom MEP poti sinteze lahko povečamo izražanje encimov sinteze in s tem produkcijo karotenoidov. S prekomernim izražanjem gena dxs in njegovega produkta encima DXS sintaze se je povečala sinteza prekursorjev karotenoidov IPP. Prav tako je bila sinteza karotenov večja v primeru kromosomskega izražanja in ne v primeru izražanja s plazmida v velikem številu kopij. Povečano izražanje so dosegli z menjavo nativnega promotorja gena dxs za promotor elongacijskega faktorja EF-Tu (Ptuf). Produkcija likopena se je prav tako povečala v primeru prekomernega izražanja gena idi (IPP izomeraza). V primeru prekomerne ekspresije obeh genov (idi in dxs) pa se produkcija ni drastično povečala, zmanjšala se je hitrost rasti bakterij v gojišču. Najvišja vsebnost likopena je bila izmerjena v primeru prekomernega izražanja dxs gena v divjem tipu z deletiranim genom crtEb (pretvarja likopen v nadalne produkte; karotenoid ε-ciklaza).