View source for Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze

'''UVOD S POVZETKOM'''

''Saccharomyces cerevisiae'' se v industriji pogosto uporablja za fermentacijo etanola. Ksiloza je ena izmed glavnih sestavin biomase in je derivat hemiceluloze. Vendar pa naravni sev ni sposoben asimilirati ksiloze in zato je v zadnjih letih veliko zanimanja za rekombinantno ''S. cerevisiae'', ki je sposobna fermentacije ksiloze. Z njeno optimizacijo bi lahko izboljšali izkoristek ksiloze v proizvodnji goriv in kemikalij. Omenjena rekombinantna kvasovka vsebuje ksilozno pot iz kvasovke, ki ksilozno pot vsebuje naravno (na primer ''Scheffersomyces stipitis''). V tej poti pride do redukcije ksiloze do ksilitola s pomočjo od NADPH odvisne ksiloza reduktaze (XR), ki je kodirana z genom ''XYL1''. Nato se ksilitol pretvori do ksiluloze s pomočjo od NAD+ odvisne ksilitol dehidrogenaze (XDH), za katero kodira gen ''XYL2''. Ksiluloza se lahko s pomočjo ksilulokonaze (XK) fosforilira do ksiluloza 5-fosfata (X-5P) in nadaljuje svoj metabolizem v pentoza fosfatni poti in glikolizi. Druga pot, po kateri lahko v enem koraku pride do pretvorbe ksiloze do ksiluloze, pa je ksiloza izomerazna pot. Uspešno so klonirali ksiloza izomerazo iz glive ''Pyromyces sp.''; produktivnost etanola je bila 1,6 - krat nižja kot pri poti XR-XDH (ksiloza reduktazna-ksilitol dehidrogenazna pot), celotna proizvodnja etanola (0,43 g/g) pa 30,0 % višja. Kljub temu se trenutno veliko znanstvenikov ukvarja z XR-XDH metabolno potjo z namenom izboljšati produkcijo etanola. Količina etanola, ki ga dobimo s fermentacijo ksiloze je zelo nizka, ker se veliko ksiloze izloči v svoji reducirani obliki, kot ksilitol. Tvorba ksilitola je povezana s preferenco kofaktorjev do XR in XDH, kar povzroči redoksno neravnotežje in vodi do akumulacije ksilitola. Produkcija ksilitola je povezana s porabo NADPH in uničuje ravnotežje reduktivnih vodikovih zvrsti. Poleg spreminjanja preference kofaktorjev, lahko izkoristek ksiloze povečamo tudi z ravnotežjem aktivnosti XR in XDH, kar bi omogočilo recikliranje NADPH in izboljšalo produkcijo etanola. Pomemben faktor pa je tudi izbira šasije kvasovk, kajti encimi ne-oksidativne pentoza fosfatne poti imajo različno aktivnost pri različnih šasijah, to pa pomeni različne sposobnosti metabolizma ksiluloze. V tej študiji so uporabili dve osnovni šasiji, W303a ter L2612.
V tej študiji so želeli rekombinantne kvasovke Saccharomyces cerevisiae uporabiti za bolj učinkovito proizvodnjo etanola iz ksiloze s pomočjo ksiloza reduktazne-ksilitol dehidrogenazne poti (XR-XDH pot). Za čimboljši izkoristek ksiloze so morali zmanjšati tvorbo ksilitola. To so naredili s kontroliranim izražanjem genov ''XYL1'' (kodira za ksiloza reduktazo - XR) in mutiranim ''XYL2'' (kodira za od NADP+ odvisno ksilotol dehidrogenazo - XDH). Za manipulacijo ekspresijskega nivolja ''XYL1'' so uporabili tri promotorje, za regulacijo izražanja ''XYL2'' pa dva plazmida z različnim številom kopij tega gena. Uporabili so dve šasiji kvasovk in sicer W303a ter L2612. Kot najuspešnejši se je izkazal sev pridobljen iz šasije L2612, ki je imel ''XYL1'' pod promotorjem PGK1 (fosfoglicerat kinaza 1) in dve kopiji ''XYL2''. Proizvajal je 21,3 % manj ksilitola in 40,0 % več etanola kot kontrolna linija.
Za ugotavljanje primerne ekspresijske ravni ''XYL1'', ki bi bila kompatibilna z ''mXYL2'', so za ekspresijo ''XYL1'' uporabili tri promotorje (celoten ADH1, ADH1; skrajšan ADH1, tADH1; PGK1) v povezavi z ''XYL2'' pod promotorjem PGK1. ADH1 je konstitutivni promotor, ki naravno v kvasovki uravnava ekspresijo alkohol dehidrogenaze. Promotor PGK1 naravno kontrolira ekspresijo fosfoglicerat kinaze, v sintezni biologiji pa je najbolj učinkovit promotor v ''S. cerevisiae'', ko želimo zagotoviti konstitutivno in visoko ekspresijo določenega gena.
Celično gostoto so spremljali z merjenjem absorbance na spektrometru pri valovni dolžini 600 nm. Iz kulture so v enakomernih časovnih intervalih odvzemali vzorce, jih centrifugirali (9600x g, 5 min) in supernatant uporabili za meritve na HPLC.


'''REZULTATI'''

''ŠASIJE W303C, W303tAR, W303AR in W303PR'' 

Linije, ki so jih pripravili iz šasije W303a, so bile W303tAR, W303AR in W303PR, pri njih je bil XYL1 pod kontrolo bodisi tADH1, ADH1 ali PGK1. Te linije so v aerobnih pogojih asimilirale 74,5 %, 146,3 % in 14,8-krat več ksiloze kot kontrola (W303C). Količina ksilitola je bila pri W303tAR in W303C približno enaka, pri W303AR in W303PR pa višja (73,5 % in 30,6 %) kot pri kontroli W303C. Kljub temu, da je bil privzem ksiloze pri W303AR večji kot pri kontroli W303C in W303tAR, pa ni nastalo skoraj nič biomase, ker se je večina ksiloze izločila v obliki ksilitola med rastjo. Za najbolj uspešnega se je pri privzemu ksiloze v šasiji W303a torej izkazal promotor PGK1. Da bi ugotovili sposobnost linije W303PR za produkcijo etanola iz ksiloze so izvajali ksilozno fermentacijo pri različnih koncentracijah ksiloze (do 50 g/l) in različnih aeracijah. Žal se je izkazalo, da do produkcije etanola ne pride, tvori pa se veliko ksilitola in zato so zaključili, da šasija W303a ni primerna za proizvodnjo etanola iz ksiloze. Razlog za ničelno produkcijo etanola bi lahko bil ta, da ksiloza inducira preusmeritev metabolizma v Krebsov cikel, kar je združljivo s celično rastjo med ksilozno fermentacijo. V nadaljevanju so se osredotočili na šasijo L2612.

''PRIMERJAVA DVEH ŠASIJ ZA EKSPRESIJO POTI XR-XDH''

Tudi v šasijo L2612 so vstavili enake tri promotroje kot v W303a in dobili nove linije L2612AR, L2612tAR in L2612PR. Samo linija L2612PR, ki je vsebovala najmočnejši promotor PGK1, je dovolj hitro rastla pod aerobnimi pogoji in konzumirala vso ksilozo. Liniji L2612AR in L2612tAR nista bili uspešni, ker je bila njuna rast počasna, konzumirali pa sta le 17,3 % in 15,7 % ksiloze. V nadaljevanju so zato primerjali liniji L2612PR in W303PR v pogojih z različno dostopnostjo kisika. Linija L2612PR je v vseh pogojih proizvajala manj ksilitola kot W303PR, kar kaže na večjo usklajenost med XR in XDH pri liniji L2612PR. Poleg tega je bilo v aerobnih pogojih pri L2612PR približno polovico manj glicerola kot pri W303PR. Ob zmanjšanju kisika se je asimilacija ksiloze zmanjšala tako pri L2612PR (za 44,8 %) kot pri W303PR (za 20,3 %), kar kaže na to, da je metabolizem ksiloze v liniji L2612PR bolj odvisen od prisotnosti kisika. Ob pomanjkanju kisika je blokirana respiratorna pot kar vodi v zmanjšan metabolizem ksiloze.
Glede na produkcijo ksilitola in glicerola so zaključili, da je šasija L2612 boljša za ekspresijo ksilozne poti za produkcijo etanola. L2612 bi lahko bila začetna linija, pri kateri bi z modifikacijami dosegli zmanjšano produkcijo ksilitola in povečali produkcijo etanola v anaerobnih pogojih.

''VPLIV RAZLIČNIH NIVOJEV ''XYL2'' NA FERMENTACIJO KSILOZE''

Od NAD+ odvisna ksilitol dehidrogenaza (XDH) je direktno povezana s pretvorbo ksilitola do ksiluloze, ki je v nadaljevanju metabolizirana v ne-oksidativni pentoza fosfatni poti (PPP). Zato so sklepali, da bo povečanje ekspresije ''mXYL2'' zmanjšalo sekrecijo ksilitola, pospešilo metabolizem v smeri ne-oksidativne PPP in posledično vodilo do povečane produkcije etanola. V liniji L2612PR so overekspresionirali ''mXYL2'' in dobili štiri linije; L2612PR-MD, L2612PR-MC, L2612PR-D in L2612PR-C. L2612PR-MD je vsebovala več kopij plazmida z ''mXYL2'', L2612PR-MC je predstavljala njeno kontrolo. L2612PR-D je imela v genom vstavljeno eno kopijo ''mXYL2'' več kot njena kontrola L2612PR-C. Najprej so asimilacijo ksiloze ter produkcijo ksilitola, glicerola in etanola testirali v aerobnih, nato pa še v anaerobnih pogojih pri vseh štirih linijah. Ugotovili so, da overekspresija ''mXYL2'' v linijah L2612PR povzroči povečano produkcijo etanola in zmanjšano tvorbo ksilitola iz ksiloze, kar kaže na to, da ima ekspresija ''mXYL2'' pomembno vlogo pri regulaciji metabolizma ksiloze.


'''ZAKLJUČKI'''

Rezultati so pokazali, da je samo najmočnejši izmed uporabljenih promotorjev (PGK1) povečal privzem ksiloze in njen metabolizem, zato sklepamo, da je nujen za visoko aktivnost XR pri fermentaciji ksiloze. Pri primerjavi fermentacijskih sposobnosti med rekombinantnimi linijami iz šasij W303a in L2612 so ugotovili, da je najbolj učinkovita linija L2612PR, razvita iz šasije L2612. Za povečanje ekspresije ''mXYL2'' so ustvarili linije z eno dodatno kopijo ''mXYL2'' (L2612PR-D) in več dodatnimi kopijami ''mXYL2'' (L2612-MD), kar je rezultiralo v 21 % nižji produkciji ksilitola in 35-40 % višji produkciji etanola. To kaže na pomembno vlogo XDH pri zmanjšani akumulaciji ksilitola in pospeševanju metabolizma ksiloze v kasnejših fazah fermentacije. Pokazali so, da je optimizacija šasij v kombinaciji z ravnotežjem metabolnih encimov primeren pristop za konstruiranje kvasovk ''S. cerevisiae'', ki fermentirajo ksilozo v etanol.


'''VIRI'''

-	Zha J., Hu M., Shen M., Li B., Wang J., Yuan Y. 2012. Balance of XYL1 and XYL2 expression in different yeast chassis for improved xylose fermentation. Frontiers in microbiology, 3, 355: 68–76

-	Graham I., Chambers A. 1997. Constitutive Expression Vectors: PGK. Recombinant gene expression protocols, 62:  159–169