View source for Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445. [http://www.pnas.org/content/100/26/15440.long| doi:10.1073/pnas.2237126100] </ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov. 

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2165| doi:10.1126/science.286.5447.2165]</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so inaktivirali posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati (znova) odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2087| doi:10.1126/science.286.5447.2087]</ref>, ki je bila v reviji Science leta  1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693. [http://www.bep.ox.ac.uk/__data/assets/pdf_file/0020/17516/Douglas.Savulescu_Synthetic.Biology_JME.2010.pdf|  doi:10.1136/jme.2010.038232] </ref>,  iz leta 2010.<br />
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
<br />
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328. [[http://www.pnas.org/content/58/6/2321.full.pdf]]</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==


{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov<br />
<small>(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)</small>
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov<br />

<small>(DNA sintetizator)</small>
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov<br />

<small>(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)</small>
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente<br/ >
<small>(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)</small>
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA<br/ >
<small>(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)</small>
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov<br/ >
<small>(gelska elektroforeza)</small>
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule<br/ >
<small>(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)</small>
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje 	
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje	
| Skupaj: ~2 tedna

|}<br/ >
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42 bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. <br/ >

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake:<br/ >
: i)	Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo <br/ >
: ii)	Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani.<br/ >
: iii)	Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo verižnega sestavljanja s polimerazo (PCA).<br/ >
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom verižnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Verižno izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA.<br/ >
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset.<br/>
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.[http://science.sciencemag.org/content/329/5987/52| doi:10.1126/science.1190719]</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični  kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.[http://science.sciencemag.org/content/351/6280/aad6253| doi:10.1126/science.aad6253]</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.
== Viri ==
<references />