View source for Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4142824/ Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases]

Ameriški raziskovalci in raziskovalke so zasnovali več nukleaz z motivi cinkovih prstov, s katerimi so gensko spremenili človeške embrionalne in inducirane pluripotentne celice. Ena genska sprememba je bila, da so v lokus ''OCT4'' v embrionalnih celicah vstavili reporterski gen, da so lahko spremljali izražanje proteina OCT4. Druga genska sprememba embrionalnih celic pa je bila vstavitev trasgenov v lokus ''AAVS1''. Tretja sprememba pa je bilo ciljanje gena ''PITX3'', ki se v embrionalnih in induciranih človeških pluripotentnih celicah ne izraža. 


== Uvod ==



=== Matične celice ===


Matične celice so celice z neomejenim potencialom za delitev in z zmožnostjo diferenciacije v različne tipe celic. Glede na njihovo zmožnost za diferenciacijo jih razdelimo v različne tipe: totipotentne, pluripotentne, multipotentne, oligopotentne in unipotentne celice. Celice v najzgodnejših fazah embrionalnega razvoja so totipotentne, kar pomeni, da se lahko razvijejo v katerikoli tip celic, tudi v trofoblast, zunanji celični sloj blastociste. Tekom embrionalnega razvoja pa potencial za diferenciacijo pada. Celice notranje mase embria so pluripotentne, kar pomeni, da se lahko razvijejo v vse tri klične plasti (endoderm, mezoderm in ektoderm), ne pa tudi v trofoblast. Ob rojstvu pa imamo le še multipotentne, oligopotentne in unipotentne celice, ki imajo zmožnost diferenciacije le v določene celične tipe ali v primeru unipotentnih celic le v eno celično vrsto.

Dolgo časa je veljalo, da diferenciranih celic ni mogoče spremeniti nazaj v manj diferencirane. Leta 2006 pa sta japonska raziskovalca iznašla način, kako že diferencirane lahko vrnemo nekaj korakov nazaj v pluripotentne celice tako, da v njih vsilimo izražanje določenih genov, ki se izražajo v celicah v zgodnejših stopnjah embrionalnega razvoja. Take celice imenujemo inducirane pluripotentne celice, za to odkritje pa je bila podeljena tudi Nobelova nagrada.


V namen raziskovanja in kasnješe morebitne uporabe pluripotentnih (tako embrionalnih kot induciranih) celic, jih je potrebno tudi gensko spreminjati. Za to pa seveda potrebujemo ustrezne metode. Opisan članek je bil objavljen leta 2009 in takrat še ni bilo na voljo metod za učinkovito gensko spreminjanje človeških pluripotentnih matičnih celic. Metode so temljile predvsem na homologni rekombinaciji med odsekom genoma in vstavljeno DNA, ki ima podobno zaporedje. Homologna rekombinacija je namreč vrsta genetske rekombinacije, pri kateri se izmenja nukleotidno zaporedje med dvema podobnima ali enakima molekulama DNA, kar se dogaja tudi v naravi, na primer ob popravljanju poškodb na DNA. Vendar je gensko spreminjanje človeških pluripotentnih celic, ki temlji le na homologni rekombinaciji, težavno in velikokrat neuspešno.  


=== Nukleaze z motivi cinkovih prstov ===


Avtorji in avtorice članka so zato v ta namen preiskusili nukleaze z motivi cinkovih prstov. To so proteini, ki imajo ločeno DNA vezavno in DNA cepitveno domeno. Cepitvena domena izvira iz restrikcijskega encima FokI in kadar je encim v dimerni obliki, je aktiven in nespecifično cepi molekulo DNA. DNA vezavna domena pa je sestavljena iz cinkovih prstov, to so približno 30 aminokislinskih ostankov veliki motivi, ki se vežejo na specifično zaporedje treh nukleotidov v DNA. Različni cinkovi prsti se vežejo na različna trinukleotidna zaporedja, zato je moč sestaviti tak protein, ki se bo vezal na neko želeno nukleotidno zaporedje. Da pa pride do cepitve DNA, se mora v neporedno bližino vezati še en protein z motivi cinkovih prstov in nukleazo FokI, saj je kot že prej omenjeno ta aktivna le v dimerni obliki. To pa nam sedaj omogoča, da z načrtovanjem ustreznih nukleaz z motivi cinkovih prstov ustvarimo zlom obeh verig DNA na točno določenem mestu.

Ker je zlom obeh verig DNA za celico usoden, obstaja več načinov, kako ga lahko celica popravi. En način popravljanja, ki pa je podvrženo napakam, je združevanje nehomolognih koncev. Pogosto se pri ponovnem združevanju prekinjenih koncev verig DNA pojavljajo delecije, insercije ali substitucije okoli mesta zloma.

Drug način popravila zloma obeh verig pa je holomogna rekombinacijo, če se v bližini nahaja homologna molekula DNA. V naravi je to lahko drug kromosom iz istega para, v laboratoriju pa lahko homologno DNA vnesemo v celico na plazmidu in med homologne konce lahko tudi ustavimo kakšen odsek DNA, na primer zapis za kakšen gen.

Verjetnost homologne rekombinacije se zelo poveča v primeru zloma obeh verig DNA, kar izkoriščamo za gensko spreminjanje celic. Na specifičnem mestu lahko z nukleazami z motivi cinkovih prstov način ustvarimo zlom obeh verig DNA ter v celico na plazmidu vstavimo še donorsko DNA, ki vsebuje homologne konce in med njimi še naš želeni odsek, ki ga želimo vstaviti. Podobno lahko na ta način ustvarjamo tudi delecije ali zamenjave določenega odseka DNA.


== Rezultati ==


Načrt za nukleaze z motivi cinkovih prstov  so naredili iz arhiva že validiranih modulov. V inducirane pluripotentne človeške celice in linijo BG01 človeških embrionalnih matičnih celic so z elektroporacijo vstavili 40 µg donorskega plazmida in 5 µg vsakega plazmida z zapisom za nukleaze z motivi cinkovih prstov.


=== OCT4 ===


OCT4 ima ključno vlogo pri samoobnavljanje nediferenciranih embrionalnih celic in izražanje tega proteina je zato tudi pokazatelj, da je celica v pluripotentnem stanju. Lokus ''OCT4'' so izbrali tudi zato, ker je to eden od redkih genov v človeških embrionalnih celicah, ki je bil že prej uspešno ciljan za genske spremembe.  Z nukleazami z motivi cinkovih prstov, ki se vežejo na mesto prvega introna gena ''OCT4'', so želeli vstaviti konstrukt, ki vsebuje zapis za eGFP in za puromicin N-acetil-transferazo. V primeru uspešne ustavitve se v celicah izražata dva proteina pod ''OCT4'' promotorjem, in sicer fuzijski protein sestavljen iz prvih 132 aminokislinskih ostankov človeškega OCT4 in eGFP ter protein puromicin N-acetil-transferaza. eGFP je kratica za izboljšan zeleni florescirajoči protein, s pomočjo katerega lahko spremljamo izražanje genov pod ''OCT4'' promotorjem. Puromicin N-acetil-transferaza  pa celice naredi odporne proti antibiotiku puromicinu, kar pomeni, da celice, ki izražajo ta gen, lahko preživijo v gojišču, kjer je prisoten puromicin. 

Po elektroporaciji so celice gojili v gojišču s puromicinom. V celicah, ki so zrasle v gojišču s puromicinom, so testirali, če se je zapis za eGFP vstavil na želeno mesto tako, da so po prenosu po Southernu za hibridizacijo uporabili sondo, ki se prilega tako na del ''OCT4'' kot na del eGFP. Pri 40 od 42 celicah se je insercija zgodila na želenem mestu. V ostalih celicah se je insercija zgodila na drugem mestu znotraj ''OCT4'' lokusa ali drugje v genomu. S prenosom western in detekcijo fuzijskega proteina s protitelesi proti OCT4 in eGFP so dokazali, da se ta tudi izraža. Ko so embrionalne matične celice diferencirali v fibroblaste, pa niso več mogli detektirati fuzijskega proteina in celice so ponovno postale občutljive na puromicin, kar dokazuje, da se geni pod promotorjem ''OCT4'' res izražajo le v pluripotentnih celicah.


=== AAVS1 ===

Na lokusu ''AAVS1'' se nahaja gen ''PPP1R12C'', ki je stalno izražen v vseh celicah. Pokazano je bilo, da je v tem lokusu možno doseči dolgoročno stabilno izražanje transgenov v več celičnih tipih, vključno s človeškimi embrionalnimi matičnimi celicami. Raziskovalna skupina je v prvem intronu gena PPP1R12C s pomočjo nukleaz z motivi cinkovih prstov vstavila gen za odpornost proti puromicinu, v enem primeru pod promotorjem gena PPP1R12C, v drugem primeru pa pod fosfoglicerolkinaznim (PGK) promotorjem. S slednjim so želeli pokazati, da je s to metodo možno vstavljati v embrionalne človeške celice tudi gene pod eksogenimi promotorji. V obeh primerih so po elektroporaciji dobili približno 50 % celic odpornih proti puromicinu in s prenosom po Southernu so dokazali, da se je insercija zgodila na želenem mestu v enem ali obeh alelih ter da ni prišlo do naključnih insercij na drugih mestih v genomu.

Nato so v lokus ''AAVS1'' s pomočjo nukleaz z motivi cinkovih prstov ustavili še gen za eGFP pod promotorjem ''CMV'' in tetraciklinskim odzivnim elementom. Po dodatku doksociklina se je izražanje eGFP znatno povečalo, s čimer so pokazali, da je v lokus ''AAVS1'' s pomočjo nukleaz z motivi cinkovih prstov mogoče vstaviti tudi inducibilne genetske kasete. 


=== PITX3 ===


PITC3 je transkripcijski faktor, ki se izraža v določenih diferenciranih celicah kot so npr. dopaminergični nevroni, vendar se ne izraža v človeških embronalnih matičnih in induciranih pluripotenitnih celicah. Raziskovalci in raziskovalke so preverili, ali lahko z nukleazami z motivi cinkovih prstov ciljajo tudi neizražene gene. Naredili so take nukleaze z motivi cinkovih prstov,  ki bi naj ustvarile zlom obeh verig DNA v prvem eksonu ''PITX3''. Na mesto prekinitve so želeli vstaviti reporter eGFP s sledečim poliadenilacijskim signalom in gen za odpornost proti puromicinu pod promotorjem PGK. Uspešnost genske spremembe je bila 11% za embrionalne in 8% za inducirane pluripotentne celice, kar so označili za relativno visoko upoštevajoč dejstvo, da so kaseto vstavljali v gen, ki se ne izraža v teh celicah.

Vse gensko spremenjene celice so ohranile pluripotentnost, kar so doazali s prisotnostjo markerjev za pluripotentnost in ker so bile zmožne tvorbe teratomov (tumorjev iz kličnih celic)


== Zaključek ==


Zaključili so, da ima gensko spreminjanje z uporabo nukleaz z motivi cinkovih prstov velik potencial za raziskave embrionalnih in induciranih pluripotentnih celic. Zaključek moramo razumeti v kontekstu leta 2009, ko v človeških matičnih celicah še niso bile v uporabi druge metode za urejanje genoma, npr. CRISPR/Cas.


== Viri ==

# [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4142824/#R10 Hockemeyer, Dirk et al. “Highly Efficient Gene Targeting of Expressed and Silent Genes in Human ESCs and iPSCs Using Zinc Finger Nucleases.” Nature biotechnology 27.9 (2009): 851–857. PMC. Web. 21 Nov. 2016.]
# [http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2006.07.024 Takahashi, Kazutoshi et al. "Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors" Cell 126.4 (2006): 663-676. Cell. Web. 21 Nov. 2016.]
# [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3176093/ Carroll, Dana. “Genome Engineering With Zinc-Finger Nucleases.” Ed. L. M. Wahl. Genetics 188.4 (2011): 773–782. PMC. Web. 21 Nov. 2016.]