View source for Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov. 

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA. 

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi. 

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice. 
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.
 
====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.
 
====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo. 

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp. 
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov. 

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease: Zinc_finger_nuclease]


[[Seminarji SB 2016/17]]