View source for Časovni in prostorski nadzor celičnega signaliziranja prek s svetlobo sprožene interakcije proteinov

Na rastlinskih fitokromih (Phy) temelji dobro znan mehanizem, ki rastlinam omogoča prilagajanje na dolžino dneva. Na proteinski del fitokroma je vezano barvilo fikocianobilin (PCB), ki spremeni konformacijo ob osvetlitvi z rdečo svetlobo (650 nm), ob osvetlitvi z infrardečo (750 nm) pa se spet povrne v začetno konformacijo – prvo obliko proteina označujemo s P<sub>r</sub> (''phytochrome red''), drugo pa s P<sub>fr</sub> (''phytochrome far-red''). Na P<sub>fr</sub> se veže protein PIF, ki ob prehodu P<sub>fr</sub> v P<sub>r</sub> oddisociira in odide v jedro, kjer deluje kot transkripcijski faktor. Oba proteina pogosto uporabljamo v sintezni biologiji, saj omogočata odzivanje celic na svetlobne signale. Ena od skupin, ki je razširila nabor možnosti tovrstnega signaliziranja, je prihajala z univerze UCSF, svoj članek z naslovom ''Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction'' pa so leta 2009 objavili v reviji ''Nature''. 
<ref >LEVSKAYA, Anselm, WEINER, Orion D., LIM, Wendell A. in VOIGT, Christopher A. [https://www.researchgate.net/publication/26807830_Spatiotemporal_Control_of_Cell_Signalling_Using_A_Light-Switchable_Protein_Interaction  Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.] ''Nature''. 2009. Št. 461, str. 997-1000.</ref>

== Ozadje in zasnova proteinov ==

Avtorji so izhajali iz več člankov, ki so se začeli pojavljati že kmalu po letu 2000 in v katerih so bili predstavljeni različni sistemi, temelječi na interakciji Phy-PIF. Osnovno idejo je prispeval članek iz leta 2002: v njem so Phy vezali na DNA-vezavno domeno proteina GAL, PIF pa na aktivacijsko domeno, ter z rdečo svetlobo sprožali prepisovanje galaktoznega operona.
<ref >SHIMIZU-SATO, Sae, HUQ, Enamul, TEPPERMAN, James M. in QUAIL, Peter H.  [http://www.nature.com/nbt/journal/v20/n10/full/nbt734.html  A light-switchable gene promoter system.] ''Nature Biotechnology.'' 2002. Št. 10, str. 1041–1044.</ref>
Neposredni prekurzor trenutnega projekta pa je bil v članku opisan leta 2008: v njem so avtorji uporabili protein Cdc42, ki spada med GTPaze družine Rho, ter protein WASP, ki aktivira kompleks Arp2/3, le-ta pa nato omogoči nukleacijo F-aktina. WASP lahko aktivira Arp2/3 le, če je nanj vezan Cdc42, to pa je v celici mogoče le, ko je na slednjega vezan GTP (ki sčasoma razpade na GDP). Izkaže se, da lahko Cdc42 deluje kot aktivator WASP tudi brez vezanega GTP, če ju spravimo v neposredno bližino. To so avtorji članka storili tako, da so pripravili fuzijski protein iz Phy in Cdc42 ter še enega iz PIF in WASP: prek obsevanja z rdečo svetlobo so lahko nato in vitro sprožili polimerizacijo aktina.
<ref >LEUNG, Daisy W, OTOMO, Chinatsu, CHORY, Joanne, ROSEN T in HOWARD, Michael K.  [http://www.pnas.org/content/105/35/12797.full  Genetically encoded photoswitching of actin assembly through the Cdc42-WASP-Arp2/3 complex pathway.] ''Proceedings of the National Academy of Sciences.'' 2008. Št. 105, str. 12797-12802.</ref>
Slednje so želeli doseči tudi avtorji članka, o katerem govori pričujoči seminar, ključni razloček pa je, da so želeli metodo, ki bi delovala ''in vivo''.

Ker je za tovrsten poskus pomembno, da lahko Phy hitro veže PCB, vnesen v celično kulturo od zunaj, so  za svoje delo izbrali mutanto PhyB Y276H (v nadaljevanju PhyB), ki je bila sposobna vezave merljivih količin PCB le 30 min po vnosu le-tega v kulturo. Nato so testirali različne verzije PIF s pripravo dveh različnih fuzijskih proteinov: eden je bil sestavljen iz YFP in PIF, drugi pa iz PhyB, fluorescenčnega proteina mCherry in prenilacijskega zaporedja, prek katerega je bil protein vstavljen v membrano; lokalizacija YFP na membrano je bila indikator moči vezave Phy-PIF. Izkazalo se je, da edina izkazuje dovolj močno vezavo na PhyB N-končna domena PIF6, pri čemer pa mora PhyB nujno vsebovati C-končno domeno PAS, saj le-ta omogoča reverzibilnost vezave. Lokalizacija YFP na membrano ter odstranitev z nje sta se izkazala kot zelo hitra procesa, katerih hitrost je bila blizu fizikalni limiti za hitrost difuzije, poleg tega pa se je sistem izkazal za zelo robustnega, saj sta prihod na membrano in odhod z nje potekla enako hitro in intenzivno tudi po več kot sto ponovitvah.

== Izvedba eksperimenta ==

=== Lokalizacija signala ===

Ker je bil glavni cilj avtorjev lokalizacija signalov v prostoru, so namesto zaporednega obsevanja z rdečo ter infrardečo svetlobo z le-tema naenkrat obsevali različne dele vzorca: z rdečo svetlobo so obsevali bodisi piko bodisi preprost vzorec, sestavljen iz nekaj pikslov, z infrardečo pa ozadje. Uspešnost lokalizacije so nato spremljali z metodo TIRF (''total internal reflection fluorescence'') mikroskopije, aplikacijo fluorescenčne mikroskopije, ki meri fluorescenco na izbrani tanki površini znotraj vzorca. Izkazalo se je, da difuzija še aktivnega kompleksa stran od mesta obsevanja sicer zamegli fluorescenco YFP, ki jo opazujemo, vendar pa so kljub vsemu uspeli jasno lokalizirati tako točkast kot kompleksnejši signal. Slednjega so tudi spreminjali s časom in posneli filmček, na katerem je razvidno premikanje na membrani skoncentriranega YFP ob premikanju svetlobnega žarka. Lokalizacijo kompleksa so nato izvajali še ob spreminjajoči se intenziteti rdeče svetlobe, kar se je izkazalo kot učinkovit način, kako regulirati koncentracijo YFP na membrani. V okviru tega poskusa so lahko približno določili tudi ''in vivo'' konstanto disociacije kompleksa: K<sub>d</sub> = 20-100 nM.

=== Spreminjanje morfologije celice ===

Končni cilj avtorjev članka je bil, da bi na osnovi sistema Phy-PIF na membrano pritegnili proteine, ki so odgovorni za spreminjanje morfologije celice in njeno migracijo. Pri tem so izhajali predvsem iz članka z univerze v Stanfordu iz leta 2005, ki je opisal vpliv različnih proteinov na morfologijo celice po tem, ko so jih pritegnili na plazmalemo. Med njimi so bile tri GTPaze iz družine Rho: Rac1, Cdc42 in RhoA. Lokalizacija Rac1 na membrano je vodila do lokalizirane tvorbe lamelipodijev, Cdc42 je povzročil nastanek filopodijev, ob prihodu RhoA pa je prišlo do celične kontrakcije. Prav tako so preizkusili, če bi lahko namesto dodatka eksogenega Rac raje aktivirali endogeni Rac z dodatkom ustreznega proteina GEF (''guanine exchange factor''), ki GTPazi zamenja GDP za GTP: izkaže se, da protein Tiam, ki deluje kot GEF za Rac1, ob svoji translokaciji na membrano sproži enako fenotipsko spremembo kot sam Rac1.
<ref >INOUE, Takanari, GRIMLEY, Joshua S., WANDLESS, Thomas J. in MEYER, Tobias.  [http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n6/full/nmeth763.html  An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.] ''Nature Methods.'' 2005. Št. 6, str. 415-418.</ref>

Iz slednje ugotovitve so izhajali raziskovalci z UCSF in se odločili, da bodo v svojih poskusih uporabljali zgolj proteine GEF. Za vsako od GTPaz, ki so jih testirali na Stanfordu, so torej poiskali ustrezen GEF: intersektin specifično aktivira Cdc42, Tim (znan tudi kot RhoGEF 5) aktivira več GTPaz iz družine Rho, že omenjeni Tiam pa je nekoliko manj specifičen, a vseeno velja, da v prvi vrsti aktivira proteine Rac. V vseh primerih so v fuzijske proteine vključili le katalitične module oz. domene DH-PH (''Dbl homology'' in ''Pleckstrin homology'') ustreznih GEF; te so dodali na C-konec že obstoječega fuzijskega proteina PIF-YFP. Vse tri konstrukte so nato testirali, pri čemer so lokalizacijo GEF spremljali prek fluorescence YFP, za spremljanje njegove aktivnosti pa so zasnovali še dva fuzijska proteina; ta sta bila sestavljena iz mCherry ter ene GBD vezavne domene, bodisi iz proteina WASP, ki se veže na Cdc42, bodisi iz proteina Pak, ki se veže na Rac1. GBD vezavna domena se je vezala na aktivirano GTPazo (z vezanim GTP), na ta način pa sta oba proteina delovala kot biosenzorja za GTPaze. Le ustreznega senzorja za RhoA žal, kot kaže, niso uspeli razviti.

Za razliko od zgoraj omenjenega članka iz Stanforda tu niso spremljali tudi polimerizacije aktina, so pa pod mikroskopom opazovali in snemali celice, ki so izražale različne GEF. Za intersektin so tako uspeli pokazati, da se ob obsevanju z rdečo svetlobo na mestu obsevanja povečata tako fluorescenca YFP (intersektin) kot mCherry (WASP), po koncu obsevanja pa približno v minuti spet padeta na začetno vrednost – niso pa uspeli pod mikroskopom pokazati jasnih morfoloških sprememb. Prav tako so te težko opazne pri poskusu s Tim; čeprav v komentarju k posnetku piše, da so na njem vidne kontrakcije celice ob prihodu Tim na membrano, pa laičnemu očesu te niso razvidne in tega so se verjetno zavedali tudi avtorji, saj rezultatov poskusa s Tim sploh niso vključili v članek. Edini poskus, kjer so nedvoumno pokazali, da lokalizacija GEF sproži morfološke spremembe, je bil tako poskus s Tiam. Tu so najprej pokazali, da se pri obsevanju območja z rdečo svetlobo na njem povečata koncentraciji Tiam in Pak, tako kot so enako uspeli pokazati že za intersektin. 
Nato so z rdečo svetlobo obsevali celotno celično kulturo in jo opazovali pod mikroskopom; do porajanja lamelipodijev je v kulturi z izraženim Tiam prišlo v bistveno večjem deležu celic kot pri kontroli. Nazadnje so poskusili še obsevati celice s snopom rdeče svetlobe, ki so ga počasi premikali: tu so dosegli verjetno najvažnejši rezultat celotne raziskave, saj so z obsevanjem roba celice sprožili nastanek lamelipodija, ko so žarek premikali na konico le-tega, pa je lamelipodij postajal vedno daljši. V 40 min obsevanja so povzročili nastanek 30 µm dolgega izrastka, kar je približno enako začetnemu premeru celice, lamelipodij pa je ostal na mestu tudi po koncu obsevanja.

== Perspektive ==

Na teh rezultatih so v naslednjih letih gradile še nove skupine raziskovalcev, ki so širile nabor organizmov, organelov in proteinov, ki jih lahko preučujemo s sistemom Phy-PIF. Skupina z UC Berkeley je tako prek Phy-PIF lokalizirala proteine na 8 različnih subcelularnih lokacij v kvasovkah.
<ref >YANG, Xiaojing, PAYNE, Anna, JOST, Tobin, WEINER, Orion D. in TANG, Chao.  [http://www.molbiolcell.org/content/24/15/2419.long  A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.] ''Molecular Biology of the Cell.'' 2013. Št. 24, str. 2419-2430.</ref>
Skupina z UCSF (nepovezana s skupino, katere članek je podlaga tega seminarja) je aplicirala sistem Phy-PIF za sprožanje signalizacije prek proteinov Ras in Erk, pri čemer se je izkazalo, da lahko sprožamo različne sekundarne signalne poti glede na to, kako dolgo traja pulz rdeče svetlobe, ki na membrano pritegne aktivatorja Ras-a.
<ref >TOETTCHER, Jared E., WEINER, Orion D. in LIM, Wendell A.  [http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(13)01417-7  Using Optogenetics to Interrogate the Dynamic Control of Signal Transmission by the Ras/Erk Module.] ''Cell.'' 2013. Št. 155, p. 1422–1434.</ref>
Verjetno najpomembnejša pa je raziskava skupine iz Londona, ki je bila objavljena leta 2016: s snopom rdeče svetlobe so lokalizirali različne proteine na želeni odsek membrane v ribjem zarodku in s tem vplivali na lokalno obliko celice.
<ref >BUCKLEY, Clare E., MOORE, Rachel E., READE, Anna, GOLDBERG, Anna R., WEINER, Orion D., CLARKE, Jonathan D. W., in CLARKE, Jonathan D. W.  [http://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(15)00796-0  Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo.] ''Developmental Cell.'' 2016. Št. 36, str. 117–126.</ref>
Tako se varianta sistema Phy-PIF z univerze UCSF pridružuje tistim sinteznobiološkim izumom, katerih neposredna prihodnost je aplikacija v medicini. Ker gre za enega najhitrejših in najnatančnejših sistemov za lokalizacijo molekul na subcelularni ravni, lahko pričakujemo, da bo do te tudi dejansko prišlo.

== Glej tudi ==

* [[Seminarji SB 2016/17]]

== Viri ==

<references />