View source for Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA-ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). PCR se ne more uporabiti za združevanje daljših molekule. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA , ki so velike tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium (vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije.

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo (3' eksonukleazna aktivnost), s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotida iz 3' konca, T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev.

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira of Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija.

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih noben od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraza. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide z precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C.

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert. 
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev večjih fragmentov, so uporabili dva sintetična dela molekul DNA M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze. 



= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo  v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov.