View source for Razvoj biološkega vezja, ki predstavi preklopno stikalo ali oscilatorno obnašanje v Escherichia coli

== Uvod ==

Članek opisuje pripravo biološkega vezja, pri katerem so avtorji uporabili komponente Lac in Ntr sistema (operona), da so ustvarili biološko vezje, ki predstavi preklopno stikalo ali oscilatorno obnašanje. Vezje oscilatorja predstavi sinhrone oscilacije, ki imajo periode veliko daljše od celičnega cikla in sicer predstavljajo genetsko uro.


== Konstrukcija vezja ==

Na začetku so si avtorji postavili 5 zahtev:
1.	Mora delovati v večjih kulturah v ravnotežju,
2.	obnašanje sistema genetske ure mora biti odporno na majhne spremembe v pogojih v kulturi,
3.	študije morajo biti preproste in ne smejo zahtevati posebne opreme, razen kemostata,
4.	mora biti mogoče razlikovati genetsko uro od drugih sistemov signalizacije v celici,
5.	genetska ura more biti primerna za regulacijo kateregakoli gena in jo lahko uporabimo za različne aplikacije.
Uporabili so elemente ntr in lac operona iz E. coli, ki so ju izbrali ker:
-	omogočata kinetično upravljanje aktivacije in represije genetske ure in 
-	sta mesti vezave aktivatorja in represorja pozicijsko neodvisna, kar olajša sestavo promotorja.

Oba vezja, genetska ura (oscilatorno vezje) in preklopno stikalo, sta si med seboj zelo podobna. Aktivatorsko vezje je enako, razlika pa se pojavi represorskem vezju. Aktivatorsko vezje je sestavljeno iz promotorja glnAp2 (vzet iz Ntr sistema), ki pa sta mu dodani dve »popolni« operatorni zaporedji iz Lac sistema- lacO. Operatorni zaporedji sta na mestih -161 in +51 od mesta začetka transkripcije. Vezje vsebuje mesto za vezavo aktivatorja NRI~P (fosforilirana oblika NRI), ki je hkrati tudi produciran z izražanjem gena gInG vključenega v vezje. S tem dobimo pozitivno povratno zanko oz. avtoaktivacijo vezja.
Represorsko vezje je v obeh primerih (genetska ura in preklopno stikalo) povezano v zanko z aktivatorskim vezjem. Razlika je v izražanju gena ''lacI'', ki zapisuje sekvenco za izražanje proteina LacI, ki predstavlja represor aktivacijskega vezja (deluje na obe mesti lacO operatoja). V primeru ocilatornega vezja represorsko vezje (enako kot aktivatorsko vezje) vsebuje vezavno mesto za ojačevalec NRI~P, vendar ima pri oscilatornem vezju ta veliko večji vpliv na promotor. Pri vezju preklopnega stikala je ta regija odstranjena, zato je promotor lacI, ki je v tem delu vezja uporabljen (vzet iz lac operona) konstitutivno izražen.
Poleg omenjenega so dodali še plazmid z zapisom za mutiran NRII protein (protein NRII2302), ki katalizira reakcijo fosfoliriranja NRI proteina. Divji NRII namreč deluje samo v določenih pogojih (zadosten vir dušika), mutiran pa deluje ne glede na pogoje.
Oba dela vezja, represorski in aktivatorski so vstavili v kromosom E. coli v eni kopiji med restrikcijska mesta za vstavljanje genov. Zunaj tega dela so vstavili zaporedje za rezistenco na antbiotike. Zapise so vstavili v mutirane seve, ki vsebujejo mutacije v zapisih za ''lacI'', ''glnG'' in ''glnL'' gene, tako da je bil vir LacI resnično pogojen samo z represorskim vezjem in vir NRI z aktivatorskim. Prav tako so vstavili plazmid z zapisom za protein NRII2302. Edini vir NRII2302 je bil torej plazmid. V teh celicah je bila ekspresija lacZYA operona in Ntr genov pod kontrolo genetske ure.


== Eksperimentalno preverjanje zasnovanega vezja oscilatorja ==


	Avtorji so preverili delovanje vezja v treh oscilacijskih ciklih lacZYA ekspresije. Sestavili so dve različni vrsti pogojev in primerjali izražanje β-galaktozidaze. Kot pogoje v mediju so v enem primeru uporabili medij z 0,4-odstotno glukozo, 0,1-odstotnim glutaminom, 100 µg/mL ampicilina in 50 µg/mL kloramfenikola. V drugem primeru so uporabili medij, ki je bil obogaten z 0,1-odstotnim kazein hidrolizatom. V obeh primerih so rezultati pokazali dušeno oscilatorno nihanje. V primeru z neobogatenim medijem je bil podvojevalni čas bakterij ~ 2 h in perioda genetske ure je bila dolga ~ 20 h, kjer so uporabili obogaten medij, je bil podvojevalni čas skrajšan na ~ 1 h in perioda genetske ure je bila dolga ~ 11 h.
	Do dušenega oscilatornega nihanja je lahko prišlo zaradi sistema načrtovanega vezja- postavitve genov ali zaradi nesinhroniziranosti celic med seboj (v tem primeru je možno, da je sistem popoln v posamezni celici, do razlik pa pride v celični kulturi). Tretja možnost je, da oscilatorji sami od sebe preidejo ven iz sinhronizacije.
	Za preverjanje izražanja LacI v eni sami celici, so se odločili fuzirati represorski promotor LacI z zapisom za CFP (angl. Cyan Flourescent Protein) in vezje vstavili v E. coli na enak način kot prej. Ekspresijo CFP so opazovali s fluorescentim mikroskopom. Rezultati so bili podobni prejšnjim, pokazali so dušeno oscilatorno obnašanje. To pomeni, da je dušena oscilacija posledica predvsem posledica organizacije načrtanega vezja.


== Priprava genetskega preklopnega stikala in eksperimentalno ovrednotenje ==

	Sestavljeno vezje začne izražati lastnosti preklopnega stikala v več različnih primerih. Eden izmed njih je, ko izražanje gena za represor (''lacI'') ni več pod nadzorom aktivatorja, temveč se konstitutivno izraža. 
	Za ovrednotenje vezja so avtorji merili delovanje encimov glutamin sintetaza in β-galaktozidaza. Pri tem vezju gre za tekmovanje med aktivatorjem in represorjem pri promotorju aktivacijskega dela vezja. Pri srednji koncentraciji represorja (koncentracija IPTG) je tako sistem v nestabilnem stanju (aktivator in represor sta ekvivalentna), kar pomeni, da bo vsaka manjša sprememba pomenila premik v eno ali drugo smer.
	Rezultati so bili podani po meritvah β-galaktozidaze (represorsko vezje) in glutamin sintetaze (aktivatorsko vezje), ki so bile opravljene po gojenju kulture čez noč v prisotnosti ali odsotnosti IPTG, nato je sledilo spiranje in menjava medija, ki je vseboval različne koncentracije IPTG. Kulture so nato rastle ~ 17 generacij.
	V obeh primerih so dobili pričakovane rezultate preklopnega stikala. »Čez nočna« prisotnost ali odsotnost IPTG skoraj ni imela učinka na koncentracijo merjene β-galaktozidaze, je pa vplivala na profil odgovora v primeru glutamin sintetaze pri srednji koncentraciji IPTG. Obnašanje je v tem primeru namreč odvisno od zgodovine celične kulture. Če je ta rastla pri visoki koncentraciji represorja, je pozitivna povratna zanka popolnoma blokirana. V nasprotju je pri nizki koncentraciji oz. odsotnosti IPTG v mediju, kjer je kultura rastla, pozitivna povratna zanka dominantna.


== Zaključek ==

	Predstavljen strokovni članek je delo iz leta 2003, kar je bil eden izmed začetnih poskusov priprave oscilatorjev in vezij s preklopnimi stikali. Danes je v literaturi dostopnih več novih poskusov, kljub temu, pa so avtorji uspešno in natančno to predstavili že pred več kot desetimi leti.


== Reference ==

1.	Atkinson, M. R., Savageau, M. A., Myers, J. T. & Ninfa, A. J. Development of genetic circuitry exhibiting toggle switch or oscillatory behavior in Escherichia coli. Cell 113, 597–607 (2003).