View source for Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE<sub>''ackA''</sub>, FRE<sub>''adhE''</sub>, FRE<sub>''frd''</sub> in FRE<sub>''ldhA''</sub>.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''. 

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE<sub>''adhE''</sub>::''fdh'', FRE<sub>''ackA''</sub>::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE<sub>''adhE''</sub>::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD<sup>+</sup>. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE<sub>''adhE''</sub>.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB-mediju, v M9-mediju in v M9-mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9-medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobno količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero  v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Prav tako so poskusili, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču in prišli do zaključka, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa bi bilo potrebo sistem še optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.
== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.