View source for Biosinteza alkanov v nitasti glivi Aspergillus carbonarius s heterologno ekspresijo acyl-ACP/CoA reduktaze in oksigenaze za deformilacijo aldehida iz cianobakterije Synechococcus elongatus

<h2>UVOD</h2>
Proizvajanje  biogoriv iz maščobnih kislin v mikrobih je zadnja leta vzbudilo veliko zanimanje, saj bi napredna biogoriva lahko popolnoma nadomestila konvencionalna goriva. Najprimernejši so srednje in dolgoverižni alkani, saj se le-te lahko zaradi lastnosti izgorevanja uporabljajo v že obstoječih motorjih z notranjim izgorevanjem. 
V cianobakterijah so nedavno identificirali dva pomembna gena v metabolni poti maščobnih kislin: gen za acil-ACP/CoA reduktazo (FAR) in gen za oksigenazo za deformilacijo aldehida (FADO). Ta dva encima sta odgovorna za pretvorbo C<sub>n</sub> maščobne acil-ACP/CoA v C<sub>n</sub> maščobne aldehide in pretvorbo le-teh v C<sub>n-1</sub> alkane (pentadekane, heptadekane in metil-heptadekane).
Heterologna ekspresija teh genov v ''E.coli'' je vodila do titrov 580 mg/l, produkcija alkanov s pomočjo teh encimov pa je pri evkariontih še precej neraziskana, zato so v tej študiji kot celično tovarno za proizvodnjo alkanov uporabili nitasto glivo ''Aspergillus carbonarius''. Vnesli so ji gene za FAR in FADO cianobakterije ''Synechococcus elongatus'', kar je vodilo do ''de novo'' sinteze pentadekanov in heptadekanov. 

<h2>MATERIALI IN METODE</h2>
<h3>Uporabljen sev in pogoji rasti</h3>
Uporabili so nitasto glivo ''Aspergillus carbonarius'' ITEM 5010 iz zbirke ATCC. Za študije proizvodnje alkanov so uporabili tri gojišča: gojišče z glukozo; gojišče z izvlečkom ovsa; gojišče YM (3% izvlečka kvasovke, 3% izvleček sladu, 10% glukoze). Kulture so rasle na 30 °C dni.

<h3>Ekspresijski vektor in transformacija</h3>
Ekspresijski vektor FAR/FADO je sestavljen iz zapisa za FAR s Tef1 promotorjem in CoxA terminatorjem ter zapisa za FADO s CoxA promotorjem in TrpC terminatorjem. Za transformacijo protoplastov so uporabili ekspresijski vektor pCB1004TDR z zapisom za selekcijski marker higromicin B. Izvedli so transformacijo protoplastov ''A. carbonarius'' z ektopično integracijo ekspresijskega vektorja v genom.
Naključno so izbrali nekaj transformant in jih prenesli na selektivno gojišče. Izolirali so genomsko DNA s pomočjo kationskega detergenta CTAB in ekstrakcijo s fenolom in kloroformom. Genomsko DNA s uporabili kot matrico za PCR reakcijo. Sedmim izbranim transformantam so izolirali celokupno RNA, pretvorili mRNA v cDNA in izvedli PCR. S PCR so pomnožili nekaj sto bazni parov dolgo terminalno regijo FAR in FADO genov. Kot kontrolo so uporabili pomnoževnje beta-aktina.

<h3>Analiza</h3>
Izmerili so tudi koncentracije prostih maščobnih kislin in trigliceridov ter izvedli analizo maščobno kislinskih metilnih estrov (FAMEs) z detekcijo s plinsko kromatografijo v kombinaciji s FID detektorjem. Za detekcijo alkanov so uporabili plinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (GC/MS).

<h2>REZULTATI</h2>
<h3>Selekcija transformant</h3>
Kot kontrolo so s PCR pomnoževali zapis za beta-aktin, za katerega so pri analizi cDNA dobili 160 bp dolge fragmente, pri analizi gDNA pa 220 bp dolge fragmente, kar potrjuje uspešnost izolacije mRNA, pretvorbe v cDNA in PCR reakcije. Samo pri eni izmed sedmih izbranih transformant je prišlo do hkratnega izražanja obeh genov (FAR in FADO). To transformanto so izbrali za analizo proizvodnje alkanov.

<h3>Proizvodnja alkanov</h3>
Z analizo transformant in starševskih sevov z GC/MS so potrdili proizvodnjo pentadekanov in heptadekanov pri transformantah, medtem ko pri starševskih sevih ni bilo prisotnih nobenih alkanov. Količina nastalih alkanov se je močno razlikovala glede na različne vire ogljika. Največ alkanov je nastalo pri uporabi gojišča z izvlečkom ovsa in sicer 2.7 mg/ml pentadekanov in 10.2 mg/l heksadekanov.

<h3>Določanje prostih maščobnih kislin, FAMEs in trigliceridov</h3>
Transformante imajo več prostih maščobnih kislin in trigliceridov kot starševski sev. S FAMEs analizo so pri transformantah in starševskemu sevu določili štiri različne vrste maščobnih kislin: palmitinska kislina (C16:0), stearinska kislina (C18:0), oleinska kislina (C18:1) in linolna kislina (C18:2). Glede na starševski sev je bila količina le-teh malenkost večja pri transformantah.

<h2>ZAKLJUČKI</h2>
Heterologna ekspresija FAR in FADO cianobakterije ''S. elongatus'' v ''A. carbonarius'' je vodila do nastanka alkanov, predvsem pentadekanov in heptadekanov. Iz rezultatov lahko sklepamo, da metabolizem v ''A. carbonarius'' poteka podobno kot v cianobakteriji, torej FAR reducira C<sub>n</sub> maščobni acil-ACP v C<sub>n</sub> maščobni aldehid, FADO pa le-tega pretvori v C<sub>n-1</sub> alkan. Za produkcijo C15:0 in C17:0 alkanov so torej potrebni intermediati C16:0 in C18:0, ki so glede na analizo FAME prisotni pri ''A. carbonarius''. 
Z analizo trigliceridov in prostih maščobnih kislin, ki so pri transformantah povečane, smo ugotovili kompetetivno pot maščobnih aldehidov zaradi prisotnosti endogenega encima FALDH.
''A. Carbonarius'' je že znana proizvajalka pomembnih sestavin reaktivnih goriv (tetradekani in heksadekani), s to študijo pa so dokazali, da s heterologno ekspresijo dveh genov ''S. elongatus'' nitasta gliva lahko proizvaja tudi pentadekane in heptadekane, ki so pomemben del naprednih biogoriv.