View source for Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji Escherichia coli

Povzeto po [http://2017.igem.org/Team:Uppsala projektu iGEM ekipe s švedske univerze Upsalla, 2017]

(Sara Kimm Fuhrmann)


==Uvod==
Skupina študentov s švedske univerze Upsalla je na iGem tekmovanju leta 2017 predstavila projekt, ki so ga poimenovali Crafting crocin. Njihov namen je bil vzpostaviti biosintezno pot za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli''. Krocin je apokarotenoidni pigment v žafranu, začimbi, ki jo pridobivamo iz rastline ''Crocus sativus''. Krocin in njegovi prekurzorji so potencialne nevroprotektivne in protitumorske učinkovine, vendar je potrebno opraviti več raziskav za ugotavljanje njihove uporabnosti v medicinske namene. Prav tako bi jih lahko uporabljali v industriji kot barvila. Vendar pa je cena žafrana zaradi pogojev pridelave zelo visoka, izolacija posameznih spojin pa je ekonomsko neugodna. S pridobivanjem krocina v bakteriji ''E. coli'' želi iGEM ekipa bistveno znižati proizvodne stroške in s tem odpreti več možnosti za nadaljnje raziskave.


==Biosintezna pot krocina==
Ekipa je želela v ''E. coli'' vzpostaviti biosintezno pot iz osmih korakov, ki se začne z endogenim farnezil pirofosfatom. Geranilgeranil difosfat-sintaza pretvori farnezil pirofosfat v geranilgeranil pirofosfat. Sledi pretvorba v fitoen s fitoen-sintazo. Fitoen-desaturaza pretvori fitoen v likopen, tega pa pretvori likopen-ciklaza v β-karoten. Z delovanjem β-karoten-hidroksilaze nastane zeaksantin. Karotenoid-cepitvena-dioksigenaza pretvori zeaksantin v krocetin dialdehid. Aldehiddehidrogenaza nato oksidira aldehidni skupini na vsakem koncu, da nastane krocetin. Krocin nastane po delovanju UDP-glukuronoziltransferaze.

===Biosintezna pot od farnezil pirofosfata do zeaksantina===
Že ekipe iz prejšnjih tekmovanj so uspele pripraviti sev ''E.coli'', ki je proizvajal zeaksantin po transformaciji z ustreznimi plazmidi. Uporabili so 5 genov iz bakterije ''Pantoea ananatis'', ''crtE'' (kodira za geranilgeranil pirofosfat-sintazo), ''crtB'' (kodira za fitoen-sintazo), ''crtI'' (kodira za fitoen-dehidrognazo), ''crtY'' (kodira za likopen-ciklazo) in ''crtZ'' (kodira za β-karoten-hidroksilazo) [Edinburgh iGEM 2007].
Letošnja ekipa pa se je odločila te gene prenesti na kromosom bakterije, s čimer bi se znebili tudi potrebe po stalnem izvajanju selekcijskega pritiska.
Uporabili so sistem rekombinacije, posredovane s proteini bakteriofaga lambda Red. Pri tej metodi v sev ''E. coli'', ki izraža proteine bakteriofaga lambda Red, vnesemo linearno donorsko DNA matrico, ki je lahko dvo ali enoverižna. Proteini Gam (preprečuje razgradnjo linearne DNA matrice z endogenima nukleazama RecBCD in SbcCD), Exo (eksonukleaza, ki ustvari 3' štrleče konce ) in Beta (ščiti ssDNA in sodeluje pri prileganju na tarčo) katalizirajo homologno rekombinacijo med donorsko in tarčno DNA. Če uporabljamo enoverižno donorsko DNA, potrebujemo samo proteine Beta [Kenkel, 2016]. Donorska DNA matrica mora vsebovati na obeh koncih vsaj 35 bp dolgo zaporedje, ki je homologno ciljani regiji. Ker inserti ne smejo biti daljši od 3000 bp, so pripravili več donorskih DNA matric, ki so jih ali naročili ali pa pripravili sami z reakcijo PCR, pri čemer so uporabili ustrezne začetne oligonukleotide. Na koncu so dobili tri donorske DNA matrice: prva s ''crtE'' in ''crtB'', druga s ''crtZ'' in ''crtY'' in tretja s ''crtI''. Želeli so jih vključiti na različna mesta na kromosomu. Vsaka matrica vsebuje drugačen konstitutiven promotor, da med matricami ni neželjene homologije, ki bi lahko motile sestavljanje.
Sev ''E.coli'', ki so ga uporabili za rekombinacijo, vsebuje plazmid z zapisi za proteine lambda Red in rezistenco na tetraciklin (pSIM5-tet ali pSIM6). Ori plazmida je občutljiv na temperaturo, kar nam omogoča, da se rekombinaznega sistema enostavno znebimo, ko ga ne potrebujemo več [Kenkel, 2016].
Pripravili so tri seve ''E.coli'', ki so vsebovali selekcijsko kaseto ''cat-SacB'' (gen za rezistenco na kloramfenikol in gen, ki kodira levansukrazo, ki ob prisotnosti sukroze povzroči propad gramnegativnih bakterij) na različnih tarčnih mestih.
Z metodo lambda Red so najprej zamenjali selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' s ''crtI'' v prvem sevu. Če do zamenjave kasete s ''crtI'' ne pride, bakterije na gojišču z dodano sukrozo ne zrastejo.
Na enak način so pripravili drugi sev, le da so selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' zamenjali s ''crtZ'' in ''crtY''. S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1 so v prvi sev (s ''crtI'') vnesli novo selekcijsko kaseto ''cat-sacB''. Nato pa so z metodo lambda Red selekcijsko kaseto zamenjali s ''crtE'' in ''crtB''. Kolonije, ki so uspešno prejele vključek, so se obarvale svetlo rdeče, saj so pričele sintetizirati likopen. 
S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1, kjer so kot donorski sev uporabili sev s ''crtZ'' in ''crtY'', kot prejemniški sev pa sev s ''crtI'', ''crtE'' in ''crtB'', so pripravili končni sev ''E.coli'', ki je sintetiziral zeaksantin. Kolonije so se zato obarvale rumeno.
Uspešnost posameznih korakov so potrdili z reakcijo PCR, gelsko elektroforezo in sekvenciranjem. Zeaksantin so uspešno izolirali in očistili iz proizvodnega seva. Da pa je bil izoliran produkt resnično zeaksantin, so potrdili s primerjavo absorpcijskih spektrov izoliranega zeaksantina in standarda.

===Biosintezna pod od zeaksantina do krocina===
Na podlagi literaturnih podatkov so izbrali zadnje tri encime v biosintezni poti krocina. Izbrali so karotenoid-cepitveno-dioksigenazo iz rastline ''Crocus Ancyrensis'' (CaCCD2), aldehiddehidrogenazo 2946 (CsADH2946) in UDP-glukuronoziltransferazo 2 (UGTCs2) iz rastline ''Crocus Sativus''. Kodon so optimizirali za izražanje v bakteriji ''E.coli''. S homolognim modeliranjem so ugotovili, da so N konci usmerjeni navzven (stran od proteina), zato so se odločili, da lahko na N konce dodajo še his-tag. Gene  so naročili pri podjetju IDT.
Z metodo sestavljanja po Gibsonu so posamezne gene vključili v plazmide pSB1CR, ki so jih predhodno linearizirali v reakciji PCR z DNA polimerazo Phusion. Za vsak encim so pripravili dve različni biokocki, eno s konstitutivnim promotorjem in drugo z inducibilnim lac promotorjem. Biokocke z inducibilnimi promotorji so sestavili v en plazmid z načinom sestavljanja 3A. 
Plazmid so z elektroporacijo vnesli v prej pripravljen sev ''E. coli'', ki proizvaja zeaksantin. Tako pripravljen sev ''E. coli'' vsebuje celotno biosintezno pot za sintezo krocina. Kolonije so rumene barve.
Za analizo spojin izoliranih iz bakterij so uporabili tankoplastno kromatografijo - TLC. Zaradi velikega števila različnih pigmentov, ki nastanejo v biosintezni poti, TLC ne omogoča dovolj dobre ločljivosti za identifikacijo posameznih pigmentov. Zato želijo v prihodnosti izolirane spojine analizirati in identificirati s primernejšimi metodami kot je npr. tekočinska kromatografija v povezavi z masno spektrometrijo – HPLC-MS.


==Modeliranje==
Encimi odgovorni za katalizo zadnjih treh stopenj v biosintezni poti so dokaj novo odkriti in še niso dobro okarakterizirani. Prav tako strukture teh encimov niso poznane. 
S pomočjo homolognega modeliranja, ki temelji na podobnosti aminokislinskega zaporedja med matričnim proteinom z znano 3D strukturo in preiskovanim proteinom, so prikazali možne 3D strukture za vse tri encime. Na podlagi teh rezultatov predpostavljajo, da sta UGTCs2 in CaCCD2 monomera, CsADH2946 pa je tetramer. S simulacijami molekulske dinamike so pokazali, da so tako pripravljeni modeli stabilni pri pogojih, ki so podobni fiziološkim.
S simulacijami so preučevali tudi afiniteto CsADH2946 do substrata. Primerjali so vrednosti za substrat krocetin dialdehid in acetaldehid. Pokazali so, da je encim specifičen za krocetin dialdehid in da je afiniteta vezave v µM rangu. CsADH2946 so s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo tudi izolirali in preverili njegovo aktivnost. Na podlagi rezultatov testiranja encimske aktivnosti, kjer so spremljali razlike v absorbanci po izpostavitvi substrata encimu, so določili Michaelisovo konstanto (Km = 20.7842 µM ± 3.5264). Nizka vrednost konstante nakazuje na visoko afiniteto do krocetin dialdehida, kar se sklada z njihovimi simulacijskimi analizami.

==Zaključek==
Ekipa s švedske univerze Upsalla je uspela pripraviti sev ''E.coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina. Prvih pet genov v biosintezni poti so prenesli na bakterijski kromosom, preostali trije geni pa so na plazmidu. V prihodnosti želijo tudi te prenesti na kromosom. So prvi, ki so očistili, potrdili aktivnost CsADH2946 in določili kinetične parametre encima.
Iz seva ''E. coli'', ki vsebuje biosintezno pot za zeaksantin so uspešno izolirali in očistili omenjeni produkt. Koliko je znašal titer, niso navedli.
Pigmentov izoliranih iz seva ''E. coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina, žal niso uspeli identificirati, ker niso imeli na voljo ustrezne metode.


==Viri==
Crafting crocin. iGEM. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://2017.igem.org/Team:Uppsala

Kenkel B. 2016. Lambda Red: A Homologous Recombination-based Technique for Genetic Engineering. Addgene. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering

Edinburgh 2007 iGEM Team Parts. iGEM. Pridobljeno 2.12.2017. Dostopno na naslovu: http://parts.igem.org/cgi/partsdb/pgroup.cgi?pgroup=iGEM2007&group=Edinburgh