View source for Enkabcillus - to je past!

Enkabcillus je študentski projekt [http://2017.igem.org/Team:TU_Dresden iGEM] ekipe TU Dresden, ki predstavlja nov pristop k inkapsulaciji in uporabi bakterij. Temelji na tvorbi kroglastih zamreženih struktur, imenovanih peptidosomi, v katere je mogoče zajeti bakterije. Zaradi stabilnosti in selektivno prepustnega ovoja peptidosomov, lahko zajete bakterije preživijo, rastejo, komunicirajo z okolico in tako lahko izkoriščamo njihove lastnosti, hkrati pa preprečimo njihov izpust v okolje.
Projekt je prejel zlato medaljo. V register so prispevali 112 novih biokock.

(Marija Kisilak)


==Peptidosomi==


Peptidosomi nastanejo s samozdruževanjem Fmoc-FF molekul (9-fluorenilmetoksikarbonil difenilalanin). Ob ustrezni izvedbi nastanejo kroglaste strukture, izpolnjene s tekočino, ki zajetim bakterijam omogočajo preživetje in opravljanje danih nalog. Zamrežena ovojnica omogoča selektivno izmenjavo spojin z difuzijo, bakterije pa ostanejo ujete v notranjosti. Tako lahko izkoriščamo lastnosti ujetih bakterij in hkrati preprečimo njihov izpust v okolico.

===Tvorba peptidosomov===

Kapljica alkalne raztopine Fmoc-FF (pH 10,5) na ultra-hidrofobni PTFE membrani tvori skoraj popolno kroglico. V bazičnih pogojih so Fmoc-FF molekule negativno nabite in se zato medsebojno odbijajo. Če pa površino take kroglice za 10 minut izpostavimo plinastemu CO<sub>2</sub>, bo pH na površini padel, karbonilna skupina Fmoc-FF se bo protonirala in molekule se bodo začele samozdruževati, tako bo okrog kapljice nastal zamrežen ovoj. Če so v kapljici suspendirane bakterije, bodo ostale zajete v notranjosti peptidosoma. Tako pripravljeni peptidosomi so stabilni več dni, tudi ob inkubaciji pri 37°C v stresalniku.

===Inkapsulacija bakterij===

Ključna pogoja inkapsulacije bakterij sta zadrževanje bakterij v notranjosti peptidosoma in izmenjava snovi med notranjostjo in okolico. Z enostavnimi difuzijskimi eksperimenti so pokazali, da peptidosomi omogočajo izmenjavo snovi z okolico: ob prenosu peptidosoma (ki vsebuje pH indikator krezil vijolično) v vodo ali tekoče LB gojišče, po določenem času zaradi difuzije indikatorja pride do razbarvanja peptidosoma.

Za prve teste inkapsulacije so uporabili reporterska seva ''Bacillus subtilis'' TMB4131 W168 ''lacA''::''erm'' P<sub>veg</sub>-''sfGFP'' in TMB3090 W168 ''sacA''::''cat'' P<sub>veg</sub>-''luxABCDE'', ki konstitutivno izražata sfGFP oziroma luciferazo, tako da so lahko spremljali lokalizacijo bakterij z merjenjem fluorescence ali luminiscence. Z bralcem plošč so potrdili, da se bakterije nahajajo samo v peptidosomih in ne prehajajo v okoliški supernatant.
Uspešnost zajetja ''Bacillus subtilis'' so dodatno preučili s pomočjo krioelektronske mikroskopije z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Ugotovili so, da pri tvorbi ovoja veliko bakterij ostane le delno zajetih v peptidosomu, zato je le-tega pred inkubacijo potrebno dvakrat sprati s svežim medijem, da se prepreči prenos bakterij v okolico.

Ker so peptidosomi izpolnjeni s tekočino in omogočajo izmenjavo snovi z okolico, populacija bakterij v njih lahko raste. Kot dokaz so vse peptidosome pripravili z enakim številom bakterij, nato pa so posamične peptidosome inkubirali različno dolgo pri 37°C. Po danem času so z njihovo vsebino inokulirali agarne plošče in po prekonočni inkubaciji dokumentirali število kolonij. Daljši inkubacijski časi peptidosomov so vodili do večjega števila kolonij na ploščah.


==Β-laktamski biosenzor==


V zadnjih letih velik problem predstavlja vse večja odpornost bakterij na antibiotike, zato se povečuje potreba po odkrivanju novih spojin. Iskanje le-teh bi lahko olajšali celični biosenzorji, ki bi se poleg tega lahko uporabljali tudi za zaznavanje prisotnosti antibiotikov v pitni ali odpadni vodi. Pri projektu so pripravili β-laktamski biosenzor v ''B. subtilis'' z uporabo ''bla'' operona iz ''Staphylococcus aureus''.

===Priprava biosenzorskih sevov===

''Bla'' operon pri ''S. aureus'' omogoča zaznavanje in odpornost na β-laktamske antibiotike. Biosenzorske seve ''B. subtilis'' so pripravili s prenosom regulatornih elementov iz ''bla'' operona, gen ''BlaZ'' pa so zamenjali z ''luxABCDE'' operonom. Pripravili so štiri genetske konstrukte:
receptorski gen ''blaR1'' pod kontrolo močnega konstitutivnega promotorja P<sub>veg</sub>,
receptorski gen ''blaR1'' pod kontrolo inducibilnega promotorja P<sub>xylA</sub>,
represorski gen ''blaI'' pod kontrolo srednje močnega konstitutivnega promotorja P<sub>lepA</sub> in
tarčno promotorsko regijo ''bla'' operona (P<sub>blaZ</sub> in P<sub>blaR1</sub>) v kombinaciji z ''luxABCDE'' operonom.

===Testiranje biosenozorjev===

Pripravili so tri biosenzorske seve, pri katerih so nato določili občutljivost za 6 β-laktamskih antibiotikov: ampicilin, cefaleksin, cefoksitin, cefoperazon, karbenicilin in penicilin G. Za pozitivno kontrolo so uporabili bacitracin, za negativno pa vodo.
Najprej so merili luminiscenco v tekočem mediju, kjer se je kot najbolj učinkovit izkazal biosenzor W168 ''thrC''::pBS4S-P<sub>lepA</sub>_''blaI'' ''lacA''::pBS2E-P<sub>veg</sub>_''blaR1'' ''sacA''::pBS3C-P<sub>blaZ</sub>_''lux'' ''penP''::''kan<sup>R</sup>''. Tudi pri disk difuzijski metodi se je kot najbolj učinkovit izkazal omenjeni biosenzor, zato so ga izbrali za nadaljnjo uporabo. Določili so še njegovo dinamično območje za vseh 6 antibiotikov in ugotovili, da biosenzor lahko zanesljivo zazna vse testirane antibiotike pri koncentracijah, ki so višje od 10<sup>-3</sup> μg/μl.

===Inkapsulacija biosenzorja v peptidosome===

Za preizkus učinkovitosti biosenzorja, zajetega v peptidosomih, so pripravili 4 tipe peptidosomov: brez bakterij, z divijm tipom ''B. subtilis'' W168, z biosenzorskim sevom in kontrolnim sevom, ki konstitutivno izraža luciferazo. Ob indukciji z 0,2 μg/μl cefoperazona so opazili luminiscenco le pri petidosomih s kontrolnim sevom in biosenzorskim sevom ter tako potrdili, da antibiotik lahko vstopa v peptidosom in s tem demonstrirali uporabnost inkapsuliranega biosenzorja.


==Zbirka signalnih peptidov==

Inkapsulacija biosenzorjev ni edina možna uporaba peptidosomov, saj bi le-ti lahko olajšali tudi proizvodnjo rekombinantnih proteinov in drugih snovi, ki jih bakterije izločajo v gojišče, ker omogočajo fizično ločitev bakterij in supernatanta.

''Bacillus subtilis'' se pogosto uporablja za ekspresijo proteinov, saj ima dobro zmožnost izločanja proteinov v gojišče. Tako kot pri večini drugih bakterij, je tudi pri ''B. subtilis'' izločanje proteinov večinoma regulirano preko Sec poti: na ribosomu se sintetizira protein, ki ima na N-koncu pripet signalni peptid; le-tega prepozna in veže delec, ki prepozna signal in protein transportira do membrane. Tam se protein veže v translokacijski kompleks, peptidaza pa odcepi signalni peptid. Nato se protein sprosti v supernatant, kjer zavzame nativno konformacijo.
Vendar pa učinkovitost izločanja preko Sec poti ni odvisna samo od signalnega peptida, ampak tudi od kombinacije signalnega peptida in ciljnega proteina. Pri projektu so zato pripravili zbirko signalnih peptidov in razvili metodo za visokozmogljivostno iskanje najučinkovitejše kombinacije danega proteina in signalnega peptida.

===Priprava zbirke signalnih peptidov in vektorja za vrednotenje===

''Bacillus subtilis'' vsebuje približno 170 signalnih peptidov, povezanih s Sec potjo. Pri projektu jim jih je uspelo klonirati 74. Vse so optimizirali tako, da so uporabni za grampozitivne in gramnegativne organizme, tako da je zbirka univerzalna za vse bakterije.

Za lažje presejanje vseh možnih kombinacij signalnih peptidov in ciljnih proteinov so pripravili še vektor za vrednotenje in standardiziran postopek za kloniranje. Kot osnovo so si izbrali integracijski vektor ''B. subtilis'' pBS1C1 ter modificirali klonirno mesto tako, da omogoča enostavno zamenjavo promotorja in fuzijskih parov, poleg tega pa izpolnjuje standarda RFC10 in RFC25. Splošno uporabnost metode so nato demonstrirali z optimizacijo izločanja treh proteinov - α-amilaze ''B. subtilis'', sfGFP in mCherry. Pri vseh treh proteinih jim je uspelo identificirati seve z najvišjo koncentracijo proteina v supernatantu, s sekvenciranjem pa so potem lahko določili, kateri signalni peptid je najbolj primeren v kombinaciji z danim proteinom.


==Izločanje==


Namesto izločanja enega samega proteina bi lahko v kombinaciji s peptidosomi pripravili več proizvodnih sevov in jih fizično ločeno gojili v kokulturi. Na ta način bi lahko proizvajali tudi proteinske komplekse in sicer z uporabo SpyTag/SpyCatcher sistema. Enote sistema se lahko spoji s poljubnimi ciljnimi proteini, ob izločanju teh proteinov iz celice pa se med SpyTag/SpyCatcher partnerjema tvori izopeptidna vez.

Pri projektu so pripravili N- in C-končne fuzije vseh mogočih kombinacij SpyTag in SpyCatcher s proteinoma mCherry in sfGFP. S plazmidi so transformirali ''B. subtilis'' sev WB800N (ki ne izloča proteaz). Izmerili so fluorescenco supernatantov vseh transformant, ločeno pa so izmerili tudi fluorescenco celic samih. Fluorescenca celic je bila znatno manjša kot pri supernatantu, torej je intenziteta res odvisna od izločenih proteinov.
Z NaDS-PAGE, za katero so uporabili očiščene supernatante mCherry produkcijskih sevov, so nato dokazali funkcioniranje SpyTag/SpyCatcher sistema. Na gelu so uspešno identificirali lise, ki so pripadale posameznima fuzijama mCherry-SpyCatcher in mCherry-SpyTag. Supernatanta so nato zmešali in po 4-urni inkubaciji na gelu opazili novo liso, ki je po molekulski masi ustrezala kovalentno povezanima mCherry konstruktoma.


==Komunikacija==


Za reševanje kompleksnih nalog bi bilo smiselno pripraviti različne seve bakterij, ki bi usklajeno opravljali ločene naloge. Subpopulacije bi lahko zajeli v peptidosome in jih fizično ločili, vendar bi se morala ohraniti komunikacija med populacijami.

Za prikaz komunikacije med sevi ''B. subtilis'' so pri projektu izkoristili regulatorni sistem za razvoj kompetence, ki temelji na zaznavanju celične gostote. ''B. subtilis'' ves čas izloča feromon ComX, njegova koncentracija v mediju je odvisna od gostote celic. Ko doseže pražno koncentracijo, aktivira ComP, membransko proteinsko kinazo, ki fosforilira regulator ComA, ta pa se kot transkripcijski faktor veže na več promotorjev in spodbudi transkripcijo. Končni rezultat je privzem DNA v ''B. subtilis''.

Komunikacijo so prikazali med dvema različnima sevoma - pošiljateljskim (SeSt), ki izloča ComX in prejemniškim (ReSt), ki v prisotnosti ComX da merljiv signal. SeSt sev je bil pripravljen na osnovi seva W168 (divji tip), ki mu je bila dodana inducibilna kopija gena ''comX''. Pripravili so tudi več ReSt sevov, tako da so ''lux'' operon kombinirali z različnimi promotorji kompetenčnega sistema (P<sub>srfA</sub>, P<sub>rapA</sub>, P<sub>rapF</sub>, P<sub>comG</sub>, P<sub>comK</sub>mut). S preverjanjem aktivnosti posameznih promotorjev so ugotovili, da je uporaben le P<sub>srfA</sub>, saj je bila le pri njem opažena indukcija luminiscence s ComX.

===Komunikacija med SeSt in ReSt sevoma===

Komunikacijo so najprej demonstrirali na mikrotitrskih ploščah z vstavki. ReSt in SeSt seve so ločeno vnesli na mikrotitrsko ploščo ali v vstavke za ploščo. Vstavki so zaradi porozne membrane omogočali izmenjavo snovi (ComX) med sevoma, zato so lahko zaznali luminiscenco.
Nato so SeSt sev prosto suspendirali v mediju, ReSt sev pa zajeli v peptidosom, da bi dokazali komunikacijo med prostimi in inkapsuliranimi bakterijami. Povečano intenziteto luminiscence znotraj peptidosoma so zaznali samo v primeru kokulture obeh sevov.


==Zaključek==


Pri projektu so uspešno pripravili peptidosome in jih karakterizirali kot nov sistem za inkapsulacijo bakterij. Pokazali so, da bakterije preživijo in rastejo v peptidosomih in da lahko izločajo proteine ter komunicirajo z okolico. Ker peptidosomi preprečujejo izpust bakterij, bi bili zelo uporabni, kadar bi želeli izkoriščati lastnosti bakterij, a bi se želeli izogniti uhajanju bakterij v okolje.