View source for Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij

[http://www.pnas.org/content/104/36/14283.full?sid=e70f2b9d-809b-4d58-aa08-3132a5390051/ A modular and extensible RNA-based gene-regulatory platform for engineering cellular function]

Ana Cirnski


Bazične in aplicirane biološke in biotehnološke raziskave so omejene z našo sposobnostjo vnosa informacij v žive sisteme in pridobivanja informacij iz njih. Omejujoči dejavniki v inženiringu bioloških sistemov so poročanje, odzivanje in nadzor nad znotrajceličnimi komponentami v teh sistemih.

V ta namen so želeli skonstruirati in izdelati prenosno in razširljivo platformo za zanesljivo konstrukcijo komunikacijskih in kontrolnih sistemov v različnih organizmih. 

Cilj raziskave je bil 
•predstaviti mehanizem, ki omogoča zanesljivo in modularno sestavljanje funkcionalnih sintetičnih RNA komponent in standardiziran prenos informacije med njimi
•izdelati platformo, ki se odziva na različne vhodne signale in nanje odgovori z regulacijo izražanja genov 
•vsestranskost platforme pri izvajanju specifičnih kontrolnih sistemov za regulacijo celične rasti z malimi molekulami

Izdelali so RNA ogrodje - ribocimsko stikalo, ki vsebuje dve domeni, in sicer senzor (aptamer) in sprožilec (ribocim v obliki kladiva).


==UVOD==
Ribocimi so molekule RNA s katalitično vlogo. V naravi jih najdemo v obliki intronov I. skupine (Tetrahymena), RNaze P, ribocim virusa hepatitis delta, ribocima v obliki lasnice in ribocima v obliki kladiva (hammerhead). Ta je ponavadi dolg 40+ baz (konstrukt v članku okoli 50) in deluje tako, da cepi samega sebe (ang. cis acting). Kot pri encimih je tudi tu za delovanje pomembna tri dimenzionalna struktura ribocima. Njegova pomanjkljivost pa je, da v resnici ni pravi katalizator, saj se ne more povrniti v osnovno stanje, potem ko se je že cepil.

Aptameri so sintetični oligonukleotidi, ki se tesno vežejo na specifično molekulsko tarčo. Izberemo jih iz knjižnice oligonukleotidov v postopku imenovanem SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).

Ribocimska stikala kontrolirajo izražanje genov v odgovor na prisotnost specifičnih ligandov. V naravi so našli že več kot 20 razredov ribostikal, ki vplivajo na izražanje različnih genov. Tu se stikalo nanaša na molekulo RNA, ki lahko obstaja v dveh različnih konformacijah, ki različno vplivata na izražanje bližnjega gena.


==SPECIFIKACIJA KOMPONENT IN DIZAJN OGRODJA==
Za zaznavanje vhodnih signalov so uporabili RNA aptamer, kot regulatorni element pa ribocim v obliki kladiva. Aptamere so izbrali s pomočjo metode SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) - na ta način se da generirati aptamere, ki se odzivajo na različne ligande (male molekule, peptide, proteine). Prav tako pa je mogoče s selekcijo vplivati na specifičnost in afiniteto aptamera.
Ribocim je uporaben, ker je majhen, lahko ga je načrtovati in je hiter. Deluje podobno pri različnih organizmih.

Najprej so vstavili zaporedje ribocima v 3’ UTR regijo tarčnega gena. S tem so izolirali specifično delovanje ribocima (cepitev transkripta) od nespecifičnih stukturnih vplivov na iniciacijo translacije (sekundarne strukture  v 5’ UTR zavirajo učinkovito translacijo). Poleg tega je cepitev v 3’ UTR regiji univerzalen mehanizem za destabilizacijo transkriptov tako pri prokariontih kot pri evkariontih. 
Vsak ribocimski konstrukt je na vsaki strani obdan z distančnikom, ki ga varuje pred zaporedjem okrog ribocima, ki bi lahko zavrlo njegovo delovanje prek porušenja njegove strukture. 
Z vsem tem so dosegli, da je ta sistem prenosljiv med organizmi in ga lahko kombiniramo z različnimi kodirnimi regijami.
Da bi sistem deloval tudi in vivo, so ribocim povezali z aptamerom, ki so ga pripeli na eno izmed zank, kar omogoča terciarne interakcije (te interakcije naj bi bile pomembne za stabilizacijo katalitično aktivne konformacije v fizioloških pogojih). 
Za karakterizacijo ribostikal so naredili in uporabili vektor pRzS. Ribocimske konstrukte so naredili s PCR. Vse ribocime so klonirali tri nukleotide navzdol od yEGFP (yeast enhanced GFP) stop kodona in navzgor od terminatorja ADH1. S plazmidi so transformirali kompetentne celice E. coli, zaporedja konstruktov so potrdili s sekveniranjem. Ustrezne plazmide so nato prenesli v celice S. cerevisiae. Pred in po dodatku vhodnega signala so merili relativne vrednosti fluorescence, hkrati pa so kvantificirali še količino celičnega transktripta.

==DELOVANJE SISTEMA==
Za prenos signala med domenama (iz senzorja na sprožilec) obstajata dva mehanizma - zamenjava verige (strand displacement) in drsenje vijačnice (helix slipping).
Za mehanizem zamenjave verige so naredili dve zaporedji (preklopno in tekmovalno zaporedje – ang. switching in competing strand) na ribocimu, ki tekmujeta za vezavo na bazo aptamera. Tako so naredili stikalo, ki omogoča regulacijo izražanja gena v odgovor na naraščajočo koncentracijo efektorske molekule (vhodni signal). Mehanizem deluje na principu prehajanja med dvema konformacijskima stanjema. 
ON* stikalo deluje tako, da se pri dodatku efektorja poruši struktura katalitičnega jedra ribocima. Pri tem se v aptameru izoblikuje vezavni žep za ligand (teofilin), tekmovalno zaporedje pa zamenja preklopnega.
Pri OFF stikalu je katalitično jedro v začetku deformirano, ker je tekmovalno zaporedje povezano s 5’ koncem aptamera (baza, ki je vezana na ribocim). Po dodatku efektorske molekule se zopet vzpostavi vezavni žep, pri tem pa se struktura katalitičnega jedra obnovi.
Pri mehanizmu drsenja vijačnice baza aptamera služi kot komunikacijski modul. Ob prisotnosti efektorja pride do zamika nukleotidov v bazi aptamera, kar vodi v majhne konformacijske spremembe ribocima - struktura je lahko bodisi obnovljena ali pa porušena (podobno kot pri prvem načinu).

* izraza ON in OFF se nanašata na izražanje gena, ne na delovanje ribocima (ta dva sta v obratnem sorazmerju)

==REZULTATI==
===Modularnost komponent in specifičnost delovanja===
Za testiranje modularnosti in specifičnosti delovanja so zamenjali aptamer (namesto teofilinskega zdaj tetraciklinski). Prenos informacije med obema domenama je še vedno potekal na enak način, s čimer so dokazali možnost modularnega sestavljanja platforme. Specifičnost so testirali tako, da so namesto teofilina oz. tetraciklina kot efektor dodali kofein in doksiciklin, ki sta njuna molekularna analoga. Ugotovili so, da se sistem na analoge in vitro in in vivo ne odziva. Pomembna je predvsem specifičnost in vivo, saj to pomeni, da sistem lahko deluje v kompleksnih okoljih.

===Regulacija celične rasti z majhnimi molekulami===
Namesto reporterskega proteina (yEGFP), so pred ribocim vstavili gen his5, ki sodeluje pri biosintezi histidina v kvasovkah. Kvasovke so gojili v gojišču brez histidina. Dodali so kompetitivni inhibitor 3-amino-triazol (3AT), ki inhibira produkt gena his5. S tem so dodatno obremenili ta gen, saj so za uspešno rast celice morale narediti več primarnega transkripta. Po dodatku efektorske molekule (teofilina) so spremljali spremembe v rasti celic (OD600). Celice so ob prisotnosti efektorja rasle počasneje, ko je bil uporabljen OFF konstrukt in hitreje, ko so uporabili ON konstrukt.

===Ribocimi kot in vivo senzorji za kopičenje metabolitov===
Ugotovili so, da ima teofilinski aptamer tudi majhno vezavno sposobnost za ksantin. V gojišče so zato celicam dodali ksantozin, ki so ga pretvorile v ksantin.  Uporabili so ON konstrukt, vstavljen za zapis za yEGFP, in po dodatku ksantozina spremljali količino nastalega GFP. Več kot je nastalo ksantina, višja je bila fluorescenca.

==DISKUSIJA==
Oba mehanizma delovanja izkazujeta prednosti in pomanjkljivosti pri standardiziranem prenosu informacije iz aptamera na ribocim - samo 7 od 26 testiranih modulov je imelo regulatorno aktivnost. Konstrukt na osnovi mehanizma zamenjave verige je modularno sestavljiv, celoten kompleks lahko naredimo z racionalnim de novo dizajnom, njegov odgovor pa je reprogramabilen. Drugi mehanizem (drsenje vijačnice) se ne odziva dobro na menjavanje domen, se pa ga lahko uporabi pri generaciji novih ribostikal z in vivo pregledom (ang. screening) takih elementov, ki delujejo z novimi zaporedji aptamerov, imajo različna regulatorna območja in prilagodljive regulatorne profile. Taka strategija je uporabna, ko racionalen dizajn elementov odpove. 
Ravni transkriptov v prisotnosti in odsotnosti efektorja se ujemajo z odgovarjajočimi količinami fluorescence, kar kaže na to, da cepitev gena v 3' UTR regiji vodi v razkroj in inaktivacijo tarčnega transkripta. Nivo transkriptov upade kmalu po dodatku efektorske molekule, kar nakazuje na hiter odgovor vstavljenega konstrukta.

==ZAKLJUČEK==
Pomen njihovega dela je predvsem v tem, da so uspeli narediti univerzalen sistem, ki je prenosljiv med organizmi, modularno sestavljiv in se odziva na specifični efektor. Sistem se lahko uporabi pri konstrukciji transgenih regulatornih sistemov za kontrolo izražanja genov, ki se odzivajo na molekule iz okolja, ki prehajajo celično membrano. S pomočjo tega mehanizma lahko reprogramiramo celični odgovor na spremembe v okolju. Pri vstavitvi konstrukta za reporterski protein, lahko spremljamo časovno in prostorsko odvisnost odgovora celice na različne vhodne molekule (efektorje). Zaradi splošne primernosti se te platforme lahko uporablja v sintezni biologiji, biotehnologiji in medicini.

==VIRI==
•M. N. Win in C. D. Smolke: A modular and extensible RNA-based gene-regulatory platform for engineering cellular function. PNAS 2007, 104 (36), 14283-14288. 

•D. Voet in J. G. Voet: Biochemistry (4. izd.). Hoboken: John Wiley and sons, Inc. 2011.

•D. L. Nelson in M. M. Cox:. Lehninger Principles of Biochemistry (5. Izd.). New York: W. H. Freeman and Company 2008.

•http://academic.brooklyn.cuny.edu/chem/zhuang/QD/toppage1.htm (21.1.2018)