View source for Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi

Izvorni članek: C. J. Delebecque, A. B. Lindner, P. A. Silver, F. A. Aldaye. ''Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.'' Science, 2011, 333, 470-474.[https://www.researchgate.net/publication/51245651_Organization_of_Intracellular_Reactions_with_Rationally_Designed_RNA_Assemblies]

=Uvod=

Sama tehnologija sestavljanja in povezovanja nukleinskih kislin v nanostrukture in uporaba le teh za organizacijo biomolekul je že dolgo znana, a se nekako in vivo ne uporablja. Delebecque in sodelavci v članku z zgornjim naslovom dejansko uporabijo tehnologijo in znanje sestavljanja nukleinskih kislin v nanostrukture za eksperimente in vivo. Dizajnirajo RNA zaporedja, ki se nato sestavijo v večdimenzionalne RNA sestave (diskretne, 1D ali 2D), ki imajo tudi mesta za sidranje proteinov in jih uporabijo kot neko ogrodje za prostorsko organizacijo bakterijskega metabolizma (konkretneje za vodik producirajočo metabolno pot) [1]. RNA sestavi so definirani kot sintetične nekodirajoče RNA molekule s sposobnostjo 3D zvijanja, ki nam koristijo pri prostorski organizaciji proteinov in vivo [2]. 
Večencimske reakcije so v celicah fizično in prostorsko organizirane v nekakšnih skupkih ali mako-razdelkih. Takšna prostorska organizacija pripomore k tekočemu prehajanju substrata med različnimi proteini, ki znotraj metabolne poti delujejo vzajemno, hkrati pa minimalizira medsebojne vplive različnih signalnih poti ene na drugo ter poveča izkoristek metabolne reakcije [3][4].

=Prostorsko urejanje biomolekul=

Prostorsko urejanje biomolekul je predvsem področje nanotehnologije DNA in omogoča tvorbo 1D, 2D in 3D sestavov s pomočjo parjenja nukleinskih kislin, žal pa se večinoma uporablja v in vitro sistemih [5][6][7][8][9]. Molekule RNA so bolj kompatibilne za in vivo študije, saj se konstrukcije RNA v celici proizvedejo s pomočjo transkripcijske mehanizacije in tvorijo stabilne interakcije [10][11]. RNA molekule so že bile uporabljene za izgradnjo sestavov višjega reda in vitro, ta raziskovalna skupina pa jih želi uporabiti tudi za in vivo konstrukcijo intracelularnega okolja. Raziskovana skupina načrta sintezna RNA zaporedja, ki se in vivo sestavijo v funkcionalno samostojna, 1D ali 2D ogrodja. Ta ogrodja potem uporabijo za nadzorovanje proteinov v prostoru, tako da se proteini vežejo na RNA ogrodja [1].
 

== Načrtovanje in sestavljanje RNA sestavov ==
 
 
Delebecque in sodelavci razvijejo pristop za in vivo združevanje različnih RNA v ogrodja, in sicer tako da načrtajo osnovne gradnike, ki so simetrična RNA zaporedja. RNA zaporedja vsebujejo dimerizacijsko (DD) in polimerizacijsko (PD) domeno [1]. Obe domeni sta polindromni [12]. Da preprečijo tvorbo nezaželenih povezav znotraj RNA molekule, morajo defavorizirati proces sesedanja polindromnih regij v inertne motive (ti so termodinamsko najbolj ugodni [12]), ki potem niso sposobni tvoriti RNA sestavov [13]. Vzpostaviti morajo tudi kontrolo nad vrstnim redom sestavljanja, saj se mora osnovni gradnik sestaviti še preden se molekule RNA polimerizirajo. To dosežejo s pomočjo PD domene, ki se intramolekularno zvije v lastničino strukturo. Da te lastničine zanke nastanejo, dodajo neke vrste previsne konce, ki so komplementarni delu DD domene iste RNA molekule. V zaporedja vključijo še ohlapne in neujemajoče bazne pare. Do dejanske tvorbe RNA sestavov pride, tako da se DD domena poveže z DD domeno druge RNA molekule (lahko je enaka, ni pa nujno) in s tem aktivira PD domeno, ki je ključna za nadaljnje sestavljanje RNA [1]. 
Prvo ogrodje D0 je iz ene same RNA d0, ki vsebuje tudi aptamerni domeni za vezavo ustreznih proteinov, enota se zvije v dupleks (dsRNA zanko). Na to ogrodje oziroma natančneje na aptamera se vežeta PP7 (hidrogenaza) in MS2 (feredoksin) proteina [1].
1D RNA sestav (D1) nastane, tako da se dva osnovna gradnika RNA d1 povežeta v strukturo d1-1 (neke vrste dimer), ta pa se potem naprej samozdruži oz. polimerizira v strukturo d1-2, ki se zvije, tako da tvori RNA strukturo v obliki nanocevke, ki lahko raste v eni dimenziji. D1 sestav ima izpostavljena MS2 in PP7 aptamera, ki vežeta proteine in jih tako organizirata [1].
2D RNA sestav D2 je sestavljen iz dveh različnih osnovnih gradnikov d2' in d2'' in vsaka nosi enega od aptamerov PP7 ali MS2. d2' se združi sam s sabo v dimer, in ta dimer se nato poveže še z d2'', čemur bi lahko rekli osnovna enota, in ta nato polimerizira in tvori 2D ogrodje D2 [1].

Karakterizacija RNA sestavov poteka z mikroskopom na atomsko silo. Okarakterizirajo in vitro prepisane RNA molekule d1, d2' in d2''. Ugotovijo, da iz njih nastanejo strukture (1D in 2D vlakna), ki jih opazijo tudi v celicah (in vivo poskusi). D1 sestav ima obliko vlakna ali traku, ki je posledica nalaganja osnovne enote v ravni črti. D2 pa ima obliko vlakna, ki preferenčno raste v eni smeri, ali pa je v obliki nanocevke. Kot kontrolo uporabijo analoge d1 in d2', ki imajo namesto DD domene poli-T odsek, kar prepreči aktivacijo PD domene, za katero je nujna DD domena. Monomer (d1 oz. d2') ni sposoben tvoriti osnovnega motiva in posledično RNA ogrodja [1]. 
In vivo sintetizirani sestavi D1 so zelo podobni tistim in vitro, 2D strukture nastale iz D2 so bile podobne, vendar vseeno opazno drugačne od tistih in vitro. To jim je dalo misliti, da samo zvijanje v celicah poteka nekoliko drugače. Da dokažejo, da se sestavi res formirajo in vivo, pripravijo inhibitorska zaporedja, ki se vežejo na DD domeno in in vitro preprečujejo tvorbo sestavov. Če D1 in D2 čistijo v prisotnosti inhibitorja, so skupki še vedno prisotni, kar pomeni, da nastanejo še pred lizo celic. S transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) celic potrdijo prisotnost sestavov D1 in D2. To naredijo, tako da RNA skupke označijo s fuzijskim proteinom (melalotionin-PP7), ki veže atome zlata [1].


== Izolacija in čiščenje RNA sestavov ==


Za izolacijo in čiščenje RNA skupkov iz celic, zasnujejo metodo, ki temelji na obarjanju DNA [1]. S pomočjo te metode najprej ''ujamejo'', potem očistijo in na koncu sprostijo RNA skupke [12]. Na magnetne kroglice vežejo streptavidin in biotinirano sondo DNA ter jih dodajo celičnemu lizatu. DNA sonda ima vezavno domeno za T7 terminator, ki je del vseh RNA skupkov. Elucija RNA poteka z dodatkom zaporedja, ki je komplementarno DNA sondi [1].
Nujno je omeniti, da sama tvorba RNA ogrodij ne vpliva na rast celic, vendar te celice vsebujejo več RNA (določajo jo s pomočjo qRT-PCR) glede na celice, ki so izražale mutirane analoge s poli-T RNA. To nakazuje, da so konstruirani RNA skupki odporni na degradacijo [1]. 


== Prostorsko urejanje proteinov s pomočjo RNA sestavov ==


Proteine, ki so vezani na RNA ogrodje, detektirajo s pomočjo fluorescenčne komplementacije. Zeleni fluorescenčni protein (GFP) razbijejo na dve polovici in eno pripnejo na PP7, drugo pa na MS2 protein, ki se vežeta na aptamere na RNA ogrodju. Celice z RNA sestavi bolj fluorescirajo, saj ''pripeljejo'' obe polovici GFP proteina dovolj skupaj, da se lahko povežeta, in protein začne fluorescirati. S tem pokažejo, da RNA ogrodja služijo kot mesta za umestitev proteinov in spodbujajo interakcije med proteini v celicah [1].

Prostorska organizacija proizvodnje dušika v bakterijah

Biološka proizvodnja dušika ima lahko osnove in praktične aplikacije. Koekspresija [FeFe]-hidroksilaze in feredoksina katalizira redukcijo protona do molekularnega vodika s pomočjo prenosa elektronov [14]. To metabolno pot v članku uporabijo za ugotavljaje, ali RNA ogrodja res omejujejo gibanje proteinov po prostoru. V ta namen združijo hidroksilazo z eno kopijo PP7, feredoksin pa z MS2 in naredijo analizo s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). S testom potrdijo, da se encima preko PP7 in MS2 vežeta na RNA ogrodje tako in vitro kot in vivo. Količino vodika, ki jo proizvedejo celice, določijo s plinsko kromatografijo. Želijo ugotoviti, ali RNA ogrodja pospešujejo sintezo H2. Proizvodnja vodika je bila v celicah, ki so sestavljale D0, D1 in D2 sestave, večja kot v celicah, kjer sta bila encima prosta oz. neorganizirana. Največja količina vodika nastane v celicah, ki izražajo D2, kar sovpada s teorijo, da je D2 in vivo organiziran v organelom podobne strukture, ki učinkovito koncentrirajo proteine in produkte metabolne poti, ki jo ti proteini katalizirajo [1]. 

=Zaključek=

Če na kratko povzamemo, rezultati te raziskave nakazujejo na to, da lahko RNA uporabimo za ustvarjanje arhitektur (tvorbo večdimenzionalnih kompleksnih arhitektur nanometrskega merila) in vivo [2][1]. Očitno smo sposobni s pomočjo RNA, ki imajo tako načrtane sekvence, da se lahko izotermno sestavijo v želeno strukturo in vivo, nadzorovati tudi prostorsko organizacijo proteinov v celicah. Takšne RNA sestave lahko uporabimo za organizacijo biosintezne poti in povečevanje njenega izkoristka [1]. In vivo bi se skupki RNA lahko uporabljali tudi za ustvarjanje bioloških poti v celicah [15][16]. RNA ogrodja bodo našla aplikacije na mnogih področjih, kjer je in vivo organizacija biomolekul potrebna [1]. Za sintezno biologijo ta RNA ogrodja predstavljajo novo osnovo, ki jo lahko uporabimo za povečevanje izkoristka metabolnih poti [2]. Hkrati pa je to, da smo sposobni urediti proteine in metabolne poti v prostoru, eden izmed ključnih korakov za snovanje celic [17][18].

=Viri in literatura= 

[1] C. J. Delebecque, A. B. Lindner, P. A. Silver, F. A. Aldaye. ''Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.'' Science, 2011, 333, 470-474.

[2] URL: https://cri-paris.org/rna-scaffolds/ (27. 11. 2018)

[3] W. Burack, A. Shaw. '' Signal transduction: hanging on a scaffold.'' Curr Opin Cell Biol. 2000, 12, 211-216.

[4] D. F. Savage, B. Afonso, A. H. Chen, P. A. Silver. ''Spatially ordered dynamics of the bacterial carbon fixation machinery.'' Science 2010, 327, 1258-1261. 

[5] P. W. K. Rothemund. ''Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.'' Nature 2006, 440, 297-302.

[6] N. C. Seeman. ''Nanomaterials based on DNA.'' Annu. Rev. Biochem. 2010, 79, 65-87.

[7] C. Lin, Y. Liu, H. Yan. ''Designer DNA nanoarchitectures.'' Biochemistry 2009, 48, 1663-1674.
 
[8] E. Winfree, F. Liu, L. A. Wenzler, N. C. Seeman. ''Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.'' Nature 1998, 394, 539-544.
 
[9] C. Lin, S. Rinker, X. Wang, Y. Liu, N. C. Seeman, H. Yan. ''In vivo cloning of artificial DNA nanostructures.'' Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008, 105, 17626-17631.

[10] P. Guo, Nat. ''The emerging field of RNA nanotechnology.'' Nanotechnol. 2006, 5, 833-842.

[11] L. Jaeger, A. Chworos. ''The architectonics of programmable RNA and DNA nanostructures.'' Curr. Opin. Struct. Biol. 2006, 16, 531-543.
 
[12] URL: www.sciencemag.org/cgi/content/full/science.1206938/DC1 (27. 11. 2018)

[13] P. Yin, H. M. T. Choi, C. R. Calvert, N. A. Pierce. ''Programming biomolecular self-assembly pathways.'' Nature, 2008, 451, 318-322.

[14] C. M. Agapakis, D. C. Ducat, P. M. Boyle, E. H. Wintermute, J. C. Way, P. A. Silver. ''Insulation of a synthetic hydrogen metabolism circuit in bacteria.'' J. Biol. Eng., 2010, 4, 1-15.

[15] F. J. Isaacs, D. J. Dwyer, J. J. Collins. ''RNA synthetic biology.'' Nat. Biotechnol., 2006. 24, 545-554.

[16] M. N. Win, C. D. Smolke. ''Higher-order cellular information processing with synthetic RNA devices.'' Science, 2008, 322, 456-460.

[17] J. Dueber , G. Wu, G. Malmirchegini, T. Moon, C. Petzold, A. Ullal, K. Prather, J. Keasling. ''Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux.'' Nat Biotechnol. 2009, 27, 753-759.
 
[18] S.H. Park, A. Zarrinpar, W. A. Lim. '' Rewiring MAP Kinase Pathways Using Alternative Scaffold Assembly Mechanisms.'' Science 2003, 299, 1061-1064.