View source for Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].


===Uvod===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR. 

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G<sub>30S-mRNA</sub>), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G<sub>30S-mRNA</sub>). ∆G<sub>30S-mRNA</sub> upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆G<sub>mRNA-rRNA</sub> < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆G<sub>vmesnik</sub> > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆G<sub>start</sub> < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆G<sub>pomožno mesto</sub> > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆G<sub>mRNA</sub> < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G<sub>30S-mRNA</sub> = ∆G<sub>mRNA-rRNA</sub> + ∆G<sub>vmesnik</sub> + ∆G<sub>start</sub> + ∆G<sub>pomožno mesto</sub> - ∆G<sub>mRNA</sub>. 

Vsi prispevki, razen ∆G<sub>pomožno mesto</sub>, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆G<sub>pomožno mesto</sub>, katero poveže s hitrostjo translacije.


===Potek eksperimenta===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ<sup>70</sup> in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G<sub>30S-mRNA</sub> in tako ∆G<sub>pomožno mesto</sub>: ∆G<sub>pomožno mesto</sub> = -1/β ln(F/F<sub>ref</sub>) - (∆∆G<sub>ostali prispevki</sub>).


===Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri: 

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke), 

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z  eno-verižno površino modula (A<sub>s</sub>), ki jo definira enačba: A<sub>s</sub> = 15 + P + D - H. A<sub>s</sub> je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je A<sub>s</sub>, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆G<sub>pomožno mesto</sub> je torej manjša, ko je A<sub>s</sub> večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆G<sub>pomožno mesto</sub> = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od A<sub>s</sub> razlikovale. Modul z večjo A<sub>s</sub> je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo A<sub>s</sub>, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆G<sub>pomožno mesto</sub>), translacija pa hitrejša.


===Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov pomožnega mesta===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆G<sub>pomožno mesto</sub>) minimalna. 

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆G<sub>prilagoditev</sub> (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆G<sub>prilagoditev</sub> = C<sub>1</sub>(A<sub>s</sub>)<sup>2</sup> + C<sub>2</sub>(A<sub>s</sub>) + C<sub>3</sub>. Velja, da večja kot je A<sub>s</sub> (dostopnejši modul), manjša je ∆G<sub>prilagoditev</sub>. Z ∆G<sub>razvijanje</sub> (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆G<sub>prilagoditev</sub> = 0 in ∆G<sub>razvijanje</sub> = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆G<sub>pomožno mesto</sub> = ∆G<sub>prilagoditev</sub> + ∆G<sub>razvijanje</sub>) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆G<sub>razvijanje</sub>, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (A<sub>s</sub>), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆G<sub>prilagoditev</sub> manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆G<sub>razvijanje</sub>) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆G<sub>prilagoditev</sub>) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆G<sub>pomožno mesto</sub> minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi. 

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆G<sub>pomožno mesto</sub>. Eksperimentalne vrednosti ∆G<sub>pomožno mesto</sub>, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆G<sub>pomožno mesto</sub>. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil. 


===Več modulov na pomožnem mestu===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi A<sub>s</sub>, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆G<sub>pomožno mesto</sub>. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆G<sub>drsenje</sub> > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆G<sub>drsenje</sub> tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆G<sub>pomožno mesto</sub>, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆G<sub>drsenje</sub> dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt. 


===Zaključek===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆G<sub>pomožno mesto</sub> = ∆G<sub>prilagoditev</sub> + ∆G<sub>razvijanje</sub> + ∆G<sub>drsenje</sub> in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆G<sub>pomožno mesto</sub>. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije. 

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov. 

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave. 


===Literatura===

[1]	A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, in H. M. Salis, „Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites“, Nucleic Acids Res., let. 42, št. 4, str. 2646–2659, 2014.

[2]	C. O. Gualerzi in C. L. Pon, „Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects“, Cell. Mol. Life Sci., let. 72, št. 22, str. 4341–4367, 2015.

[3]	G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, in H. F. Noller, „The path of messenger RNA through the ribosome“, Cell, let. 106, str. 233–241, 2001.

[4]	M. de Smit in J. van Duin, „Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data“, J. Mol. Biol., let. 244, št. 2, str. 144–150, 1994.

[5]	H. Salis, E. Mirsky, in C. Voight, „Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression“, Nat Biotechnol, let. 27, št. 10, str. 946–950, 2010.

[6]	S. M. Studer in S. Joseph, „Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex“, Mol. Cell, let. 22, št. 1, str. 105–115, 2006.


===Dodatek - legenda===

- ∆G<sub>30S-mRNA</sub> ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆G<sub>mRNA</sub> ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆G<sub>mRNA-rRNA</sub> ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆G<sub>vmesnik</sub> ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆G<sub>start</sub> ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆G<sub>pomožno mesto</sub> ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆G<sub>prilagoditev</sub> ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆G<sub>razvijanje</sub> ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆G<sub>drsenje</sub> ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- F<sub>ref</sub> ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- A<sub>s</sub> ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C<sub>1</sub>, C<sub>2</sub> in C<sub>3</sub> ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt<sup>2</sup>, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.