View source for CAPOEIRA - razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje

CAPOEIRA, angl. CAncer PersOnalized Encapsulin Immunotherapy and Relapse Assay (http://2018.igem.org/Team:EPFL), je letošnji iGEM projekt švicarske univerze EPFL (École polytechnique fédérale de Lausanne). Ime projekta izhaja iz brazilske borilne veščine, katere lastnosti so študenti želeli udejanjiti tudi pri svojem končnem cilju – hitrem in učinkovitem terapevtskem pristopu za zdravljenje raka na osnovi imunoterapije.

== Rak in imunoterapija raka ==
V povprečju je vsaka šesta smrt na svetu posledica raka, ki je v razvitih državah prvi ali drugi najpogostejši vzrok smrti. Ocenjujejo, da bo v letošnjem letu za to boleznijo zbolelo 18,1 milijona in umrlo 9,6 milijona ljudi<ref>Bray, F., et al., Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 2018. 68(6): p. 394-424.</ref>. Kljub dolgoletnim prizadevanjem zaradi kompleksnosti in raznolikosti bolezni učinkovitega zdravljenja večine vrst rakov še ne poznamo.

Eden izmed trenutno najodmevnejših načinov zdravljenja raka je imunoterapija – terapevtski pristop, ki v nasprotju z ostalimi ni usmerjen neposredno proti tumorskim celicam, temveč k boju proti bolezni spodbudi bolnikov lastni imunski sistem. Med najpopularnejšimi pristopi v imunoterapiji so poleg terapije z modificiranimi celicami T z izraženim himernim receptorjem za tumorske antigene (CAR-T) in poleg modulatorjev imunskih kontrolnih točk tudi cepiva proti raku<ref>Zhang, H. and J. Chen, Current status and future directions of cancer immunotherapy. J Cancer, 2018. 9(10): p. 1773-1781.</ref>.

=== Cepiva za zdravljenje raka na osnovi neoantigenov ===
V tumorskih celicah se tekom kancerogeneze kopičijo različne mutacije, zaradi katerih celice začnejo izražati t. i. neoantigene – spremenjene proteine, ki jih celice predstavijo v obliki peptidov na poglavitnem histokompatibilnostnem kompleksu razreda I (ang. major histocompatibility complex class I, MHC-I), kjer jih lahko prepoznajo citotoksične celice T. Ker so neoantigeni posledica naključnih mutacij zaradi napak v popravljalnih mehanizmih ali/in prisotnosti kancerogenih snovi, se lahko med bolniki zelo razlikujejo. Da jih odkrijemo, je potrebno posekvencirati bolnikov celoten eksom<ref>Wirth, T.C. and F. Kühnel, Neoantigen Targeting-Dawn of a New Era in Cancer Immunotherapy? Front Immunol, 2017. 8: p. 1848.</ref>. 

Na osnovi neoantigenov lahko pripravimo cepiva, ki ojačajo imunski odgovor proti rakavim celicam. Neoantigen, ki ga vbrizgamo v telo, morajo prepoznati in zajeti dendritične celice, ga ustrezno procesirati in predstaviti na MHC-I na svoji površini. V limfatičnih organih nato pride do aktivacije za predstavljeni neoantigen specifičnih naivnih CD8+ celic T in njihove diferenciacije v citotoksične celice T (celice ubijalke). Te po krvnem obtoku potujejo do tumorja in uničujejo tumorske celice, ki imajo na površini predstavljen neoantigen<ref>Aldous, A.R. and J.Z. Dong, Personalized neoantigen vaccines: A new approach to cancer immunotherapy. Bioorg Med Chem, 2018. 26(10): p. 2842-2849.</ref>.

== CAPOEIRA – opis sistema in rezultatov ==
Cilj projekta CAPOEIRA je bil razviti hiter, zanesljiv in enostaven sistem za pripravo popolnoma personaliziranega cepiva za zdravljenje melanoma ter sistem za spremljanje bolnikovega odziva na zdravljenje. 

=== Bioinformatska analiza ===
Prva pomembna stopnja v procesu priprave personaliziranega cepiva je iskanje in izbira neoantigenov. Ker standardizirana metoda za odkrivanje le-teh trenutno še ne obstaja, so študenti razvili  svojo odprtokodno programsko opremo, ki so jo poimenovali GINGA. Za analizo so potrebni eksomski podatki biopsije rakavega in zdravega tkiva bolnika. GINGA primerja oba eksoma in po skupno 11 zaporednih korakih analize izpiše knjižnico tumorskih neoantigenov, ki so razporejeni glede na vezavno afiniteto do MHC-I. Poleg tega se izpišeta tudi knjižnica kratkih zaporedij DNA, ki vsebujejo polimorfizme posameznega nukleotida, ter seznam specifičnih kromosomskih preureditev.

Programsko opremo GINGA so delno validirali na podlagi eksomskih podatkov tumorskega tkiva osmih bolnikov z melanomom, dodatne izboljšave in obširnejšo validacijo, za katero bodo morali pridobiti tudi ustrezna etična dovoljenja, pa načrtujejo v prihodnosti.

=== Razvoj cepiva ===
Za ustrezen imunski odgovor oz. aktivacijo citotoksičnih celic T morajo dendritične celice uspešno prepoznati, procesirati in predstaviti neoantigene iz cepiva na MHC-I na svoji površini. Če cepivo vsebuje le neoantigene v prosti obliki, običajno ne pride do zadostnega odziva, zato jim je potrebno dodati adjuvant, ki dodatno ojača imunski odgovor<ref>Aldous, A.R. and J.Z. Dong, Personalized neoantigen vaccines: A new approach to cancer immunotherapy. Bioorg Med Chem, 2018. 26(10): p. 2842-2849.</ref>. Ekipa EPFL je kot adjuvant in hkrati osnovno platformo za proizvodnjo cepiva uporabila enkapsulin – bakterijski protein, katerega monomeri se spontano sestavljajo v ikozaedrične multimere iz 60 podenot<ref>Sutter, M., et al., Structural basis of enzyme encapsulation into a bacterial nanocompartment. Nat Struct Mol Biol, 2008. 15(9): p. 939-47.</ref>. C-konec enkapsulina se nahaja na zunanji površini multimera, zato lahko nanj enostavno pripnemo neoantigene<ref>Moon, H., et al., Developing genetically engineered encapsulin protein cage nanoparticles as a targeted delivery nanoplatform. Biomacromolecules, 2014. 15(10): p. 3794-801.</ref>. 

Heksahistidinski povezovalec med aminokislinskima ostankoma 43 in 44 izboljša hidrodinamske lastnosti in močno poveča temperaturno obstojnost enkapsulina<ref>Moon, H., et al., Developing genetically engineered encapsulin protein cage nanoparticles as a targeted delivery nanoplatform. Biomacromolecules, 2014. 15(10): p. 3794-801.</ref>. Ker lahko slednje močno olajša izolacijo, so zapis za povezovalec v kodirajoče zaporedje enkapsulina vstavili tudi študenti EPFL. Na C-konec zapisa za enkapsulin so nato dodali še kodirajoče zaporedje sfGFP (ang. superfolder green fluorescent protein) s promotorjem in terminatorjem, obdano z restrikcijskima mestoma za BsaI. V tako pripravljen plazmid (v registru standardnih bioloških delov dostopen kot BBa_K2686005) lahko na C-konec enkapsulina s pomočjo restriktaze BsaI po sistemu Golden Gate hitro in enostavno vnesemo kateregakoli od bolnikovih neoantigenov iz knjižnice, pri čemer se gen za sfGFP odstrani. Uspešnost vgraditve neoantigena lahko tako zaznamo že vizualno, na podlagi fluorescence. Študenti so pripravili fuzijski protein enkapsulina s peptidom OT-1, ki izhaja iz ovalbumina in za katerega je bilo že predhodno dokazano, da prek dendritičnih celic učinkovito aktivira za OT-1 specifično T-celično citotoksičnost<ref>Choi, B., et al., Effective Delivery of Antigen-Encapsulin Nanoparticle Fusions to Dendritic Cells Leads to Antigen-Specific Cytotoxic T Cell Activation and Tumor Rejection. ACS Nano, 2016. 10(8): p. 7339-50.</ref>.

Da bi zagotovili hitro in cenovno ugodno proizvodnjo cepiva in omogočili enostavnejše čiščenje, so se pri projektu poslužili brezceličnega ekspresijskega sistema<ref>Sun, Z.Z., et al., Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp, 2013(79): p. e50762.</ref>, ki sestoji iz celičnega ekstrakta E. coli z dodano raztopino ATP, aminokislin in tRNA. Enkapsulin s heksahistidinskim povezovalcem oz. njegovo fuzijo z OT-1 so izražali 8–12 h pri 29 °C, nato pa so izkoristili temperaturno obstojnost enkapsulina in izvedli enostopenjsko toplotno čiščenje. Vzorce so 20 min segrevali pri 70 °C, jih nato ohladili in centrifugirali. Enkapsulin je ostal v supernatantu, medtem ko je večina ostalih proteinov denaturirala in se posedla v pelet. V manj kot eni uri so tako pripravili že dokaj čist produkt. S poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti NaDS so v vzorcih po čiščenju detektirali monomerno in multimerno obliko enkapsulina oz. njegovega fuzijskega proteina z OT-1. Uspešno izražanje peptida OT-1 so potrdili z masno spektroskopijo. Da so v vzorcu res prisotne multimerne strukture, so dokazali z analizo vzorcev z metodo dinamičnega sipanja svetlobe. 

Da bi preverili, če dendritične celice uspešno endocitirajo enkapsulin, so ga fluorescenčno označili in ga dodali v celično kulturo dendritičnih celic v matrigelu. Že po štirih urah so v celicah pod fluorescenčnim mikroskopom opazili citoplazemske agregate enkapsulina, celice so se tudi morfološko spremenile. Na podlagi rezultatov pretočne citometrije, ki so jo izvedli po inkubaciji dendritičnih celic s fuzijskim proteinom enkapsulina s peptidom OT-1, žal niso mogli potrditi, da pride tudi do uspešne predstavitve OT-1 na MHC-I.

=== Spremljanje učinkovitosti zdravljenja in zaznavanje ponovitve bolezni ===
Poleg cepiva so želeli študenti razviti tudi hitro in čim manj invazivno metodo, s katero bi lahko preverjali učinkovitost cepljenja in tudi zaznali morebitno ponovitev bolezni. Zasnovali so detekcijski sistem na osnovi endonuklaze Cas12a, s katerim bi lahko v bolnikovi krvi določali biomarkerje raka – tumorsko mikro RNA (miRNA) in za bolnikov tumor specifične mutacije in kromosomske preureditve, predhodno odkrite z bioinformatsko analizo. Znano je namreč, da so v krvi bolnikov z rakom predvsem zaradi apoptoze tumorskih celic prisotne tako tumorske miRNA<ref>O'Brien, K.P., et al., Circulating MicroRNAs in Cancer. Methods Mol Biol, 2017. 1509: p. 123-139.</ref> kot tudi fragmentirana tumorska DNA<ref>Cheng, F., L. Su, and C. Qian, Circulating tumor DNA: a promising biomarker in the liquid biopsy of cancer. Oncotarget, 2016. 7(30): p. 48832-48841.</ref>. Ker je teh zaporedij v krvi zelo malo, jih je potrebno pred detekcijo pomnožiti.

Cas12a s pomočjo vezane vodilne RNA (ang. guide RNA, gRNA) prepozna zaporedje PAM (ang. protospacer adjacent motif) in se veže na komplementarno tarčno zaporedje na drugi verigi DNA. Ob tem se protein konformacijsko spremeni in pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost – cepi tarčno DNA, pa tudi katerokoli enoverižno DNA v bližini. Študenti so v sistem zato dodali oligonukleotidno sondo z dušenim fluoroforjem (DNase Alert), ki jo aktiviran Cas12a razcepi in tako sprosti fluorofor, kar lahko enostavno detektiramo.

Učinkovitost zasnovanega testa so študenti pokazali z detekcijo dveh mutacij v genu BRAF. Ena od njiju je v bližini že vsebovala PAM, pred drugo pa so PAM dodali v koraku pomnoževanja s PCR. Pomnožena zaporedja so uporabili kot substrat za Cas12a/gRNA. Minimalna koncentracija tarčne DNA, ki je še dala zaznaven izhodni fluorescenčni signal, je bila 1 fM. V skladu z nedavno objavljeno raziskavo<ref>Li, S.Y., et al., CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov, 2018. 4: p. 20.</ref> so v primeru popolne komplementarnosti gRNA in tarčnega zaporedja izmerili vsaj dvakrat višji signal, kot če se zaporedji nista ujemali v le enem nukleotidu, kar potrjuje visoko specifičnost Cas12a/gRNA. Dokazali so tudi, da lahko specifično mutacijo zaznajo tudi, če je v vzorcu hkrati prisotna stokrat višja koncentracija nemutiranega tarčnega zaporedja. 

Na primeru kromosoma Filadelfija, ki nastane z recipročno translokacijo delov daljših ročic kromosomov 22 in 9<ref>de Klein, A., et al., A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature, 1982. 300(5894): p. 765-7.</ref>, so dokazali tudi, da sistem omogoča zaznavanje kromosomskih preureditev.

Z opisanim sistemom bi lahko detektirali tudi tumorske miRNA. Študenti so za povečanje njihove koncentracije uporabili različico izotermnega pomnoževanja na način kotalečega se kroga (angl. Toehold-initiated Rolling Circle Amplification, TIRCA). Pri tej metodi kot osnovo za pomnoževanje uporabimo sondo specifične oblike (manjša in večja zanka, povezani z dvoverižnim steblom), ki po vezavi komplementarne miRNA spremeni konformacijo v enoverižno krožno obliko, kar omogoči začetek podaljševanja z DNA polimerazo fi-29<ref>Deng, R., et al., Toehold-initiated rolling circle amplification for visualizing individual microRNAs in situ in single cells. Angew Chem Int Ed Engl, 2014. 53(9): p. 2389-93.</ref>. Študenti so na opisani način uspešno pomnožili miRNA let-7a-5p, če je bila prisotna v koncentraciji vsaj 10–100 pM. Na pomnoženi miRNA so izvedli test s Cas12a/gRNA v prisotnosti substrata DNase Alert. Zelo visoko fluorescenco so zaznali že v kontrolnih vzorcih, ki so vsebovali le sondo (ne pa tudi pomnožene miRNA), vendar verjamejo, da bi z nadaljnjo optimizacijo lahko pripravili uspešen sistem za detekcijo tumorske miRNA.

== Zaključek ==
Študenti so v projektu razvili programsko opremo, s katero lahko iz rezultatov sekvenciranja celotnega eksoma rakavega in zdravega tkiva pridobimo seznam za bolnikov tumor specifičnih neoantigenov. Zasnovali so pristop za hitro proizvodnjo personaliziranega protitumorskega cepiva, katerega učinkovitost bo potrebno še dodatno preveriti in optimizirati. Razvili so enostaven, učinkovit in specifičen detekcijski test, s katerim bi lahko hitro preverili, kako napreduje bolnikovo zdravljenje oz. zaznali morebitno ponovitev bolezni.


----
<references/>