View source for Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature13314 A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet. Nature, 2014]

----

V živih organizmih je genska informacija zapisana s pomočjo 4 različnih baz, ki tvorijo 2 različna bazna para. Takšen zapis informacij je ohranjen v vseh živih organizmih in je prisoten od zadnjega skupnega prednika. V zadnjih letih je bilo vloženega veliko dela v razvoj tako imenovanih nenaravnih baznih parov (angl. unnatural base pairs, UBP), ki bi lahko umetno ustvarjeni nukleotidi obstajali in prenašali informacijo skupaj z naravnimi nukleotidi (Dhami et al., 2014)⁠. Na ta način bi, skladno s principi sintezne biologije, lahko ustvarili prave pol-sintetične organizme, ki bi imeli nove funkcije (Malyshev et al., 2014)⁠. 

V preteklih 15 letih je bilo razvitih več nenaravnih nukleotidov, ki tvorijo pretežno hidrofobne UBP. Dva izmed najobetavnejših, ki tvorita tak par, sta nukleozida, ki imata namesto baze skupini dNaM in d5SICS. Takšni bazni pari so bili v predhodnih poskusih uspešno pomnoženi ''in vitro'', s pomočjo reakcije PCR, nikoli pa še niso bili uporabljeni ''in vivo'', saj se ob tem pojavi vrsta problemov. Nenaravni nukleotid trifosfati morajo biti dostopni v celici, endogene polimeraze jih morajo biti sposobne uporabiti in integrirati v DNA zaporedje pri replikaciji, sami UBP pa ne smejo destabilizirati genoma. Prav tako je pomembno, da jih celični popravljalni mehanizmi ne izrežejo oz. izničijo na drug način.

==Transport nukleotidov v celico==
Kot že omenjeno, je prvi problem dostopnost nenaravnih nukleotid trifosfatov v bakterijski celici. Naravni nukleotidi so namreč sintetizirani v celici, za nenaravne pa je potrebno poskrbeti drugače. Ena izmed možnosti je uvedba sinteznih poti v celico. To je bilo preizkušeno v enem od predhodnih eksperimentov, kjer so s pasivno difuzijo v celice spravili dNaM in d5SICS, kjer naj bi ju do trifosfata fosfrilirala namensko uvedena nukleozid kinaza. V praksi se je izkazalo, da se ob visokem izražanju omenjene kinaze rast bakterije močno upočasni, zato tak pristop ni primeren za ustvarjanje pol sintetičnega organizma, ki naj bi se obnašal podobno kot ''wt'' različica (Malyshev et al., 2014)⁠.
Druga možnost, ki je bila na koncu uporabljena tudi v tem primeru, pa je uvedba nukleotid trifosfatnih transporterjev (NTT) iz obligatornih znotrajceličnih bakterij. V sevu ''E. coli'' C41(DE3) so izrazili osem različnih transporterjev in spremljali njihovo učinkovitost pri transportu  radioaktivno označenega [α-32P]-dATP iz medija v celico. Kot najbolj učinkovit se je izkazal PtNTT2, poleg tega pa je iz literature znano, da ima široko specifičnost, zato je bil najboljši kandidat za nadaljevanje eksperimenta(Malyshev et al., 2014)⁠.
Da je mogoča normalna uporaba nenaravnih nukleotidov, morajo te biti dovolj stabilni tako zunaj celice kot znotraj celice. Predhodna karakterizacija uporabljenih nukleotidov pa je pokazala, da v prisotnosti rastoče ''E. coli'' prihaja do znatne razgradnje. Pogoje so s pomočjo KPi optimizirali tako, da so dosegli zadovoljivo dolgo razpolovno dobo 9 ur (Malyshev et al., 2014)⁠. 
30 min po dodatku trifosfatov je bilo v celicah s transporterjem PtNTT2 mogoče zaznati 90μM koncentracijo d5SICSTP in 30μM koncentracijo dNaMTP. Navedeni koncentraciji sta močno presegali pod-mikromolarne Km vrednosti, ki jih imajo trifosfati za DNA polimeraze(Malyshev et al., 2014)⁠.

==Podvajanje DNA==
Podvajanje DNA, ki vsebuje nenaravne nukleotide je bilo ''in vitro'' potrjeno in preverjeno predvsem s polimerazami iz družine A, kot je Klenow fragment polimeraze I (pol I) (Lavergne, Malyshev, & Romesberg, 2012)⁠. Ker v ''E. coli'' podvajanje genoma poteka s pomočjo polimeraze III, so raziskovalci ustvarili plazmid, ki je bil prisiljen v podvajanje s polimerazo I. Sintetični plazmid z UBP je vseboval analog nukleotida d5SICS, ki je bil v v primeru replikacije zamenjan s pravim d5SICS. To je raziskovalcem omogočilo enostavno diferenciacijo med sintetičnim in in vivo pomnoženim plazmidom. 

Celice s bile najprej transformirane s plazmidom pACS, ki je vseboval zapis za transporter PtNTT2 in nato gojene v gojišču, ki je vsebovalo oba nenaravna trifosfata, 50mM KPi in 1mM IPTG, ki je potreben za indukcijo izražanja transporterja. V drugem koraku so bile celice transformirane še s plazmidom pINF, ki je vseboval UBP in zapis za rezistenco na ampicilin. Po eni uri so kulture 10x razredčili in jih dali v medij z ampicilinom. Njihovo rast so nato spremljali s pomočjo optične gostote.

==Analiza rezultatov==
Da bi preverili replikacijo pINF z UBP, so po 15 urah rasti celic plazmide izolirali. Izkazalo se je, da je uvedba UBP privedla do skoraj 2x nižjega števila kopij plazmida v celici (v razmerju s pomožnim plazmidom pACS). Določili so, da je bil plazmid pomnožen 2x10⁷-krat v obdobju rasti, ki je zajemalo cca. 24 delitev. Da bi določili raven retencije UBP so plazmid razgradili, ga defosforilirali do posameznih nukleozidov in jih analizirali s pomočjo masne spektroskopije. 
Iz zaznanih signalov so določili razmerje med dA in d5SICS, ki je bilo 1106:1, kar ob primerjavi s pričakovanim razmerjem 1325:1 nakazuje na približno 1 UBP v plazmidu. V kontrolnih eksperimentih, kjer ni bilo prisotnega transporterja, ta ni bil induciran ali pa ni bilo nenaravnih trifosfatov, ni bilo mogoče zaznati nobenega UBP. To dokazuje, da prisotni UBP niso bili posledica napake polimeraze pri pomnoževanju. Pomembno je tudi dejstvo, da je sintetično narejeni pINF vseboval analog d5SICS, sam d5SICS pa je bil dodan v medij le v obliki trifosfata. Njegova prisotnost v pINF dokazuje, da je prišlo do in vivo sinteze (Malyshev et al., 2014)⁠. 

Da bi še na neodvisen način potrdili in kvantificirali rezultate, so regijo z UBP pomnožili s PCR reakcijo v prisotnosti d5SICSTP in dNaMTP, ki je imel konjugiran biotin. Analiza s s streptavidinskim gelom je pokazala, da je 67% pomnožene DNA vsebovalo biotin. Nobenega biotina ni bilo mogoče opaziti v pomnožkih, ki so jih opravili s plazmidi iz kontrolnih kultur. Opažena  retencija UBP je bila s pomočjo umeritvene krivulje izračunana na približno 86%.
Izvedli so tudi sekvenciranje z metodo po Sangerju, pri kateri je na mestih UBP vedno prišlo do terminacije. Na podlagi ocene, da je pri tej metodi možno zaznati do cca. 5% DNA, je mogoče zaključiti, da je bila ohranjenost UBP nad 95% (Malyshev et al., 2014)⁠. 

Vsi zbrani podatki tako kažejo, da je ekipi uspelo pripraviti organizem, ki in vivo pomnožuje in ohranja DNA zaporedje, ki ga sestavlja 6 različnih baznih parov, 2 izmed katerih sta nenaravna in se v naravi ne pojavljata. Glede na analizo plazmidov je mogoče izračunati, da je retencija UBP na delitev 99,4% (24 delitev z retencijo 99,4% na koncu prinese retencijo 86%). Taka natančnost sovpada z relativno nizko pogostostjo napake, v velikostnem razredu 10⁻³, kar je primerljivo s pogostostjo intrinzičnih napak nekaterih polimeraz v bakterijskih celicah (Malyshev et al., 2014)⁠.
Glede na število delitev in čas gojenja je mogoče tudi zaključiti, da UBP ne moejo biti uspešno izrezani z bakterijeskimi popravljalnimi mehanizi DNA (Malyshev et al., 2014)⁠.

==Retencija UBP v stacionarni fazi==
Da bi bolje testirali kako se UBP ohranja s podaljševanjem stacionarne faze, je ekipa ponovila prejšnje eksperimente, le da so spremljali retencijo UBP do 6 dni, brez dodajanja novih trifosfatov v gojišče.Tudi v tem primeru je UBP ostal prisoten v plazmidu v 45% po 3 dneh in 15% po 6 dneh. V primerih, kjer je bil UBP odsoten, je mesto zasedel naravni bazni par dA-dT, kar je skladno z mutacijskim spektrom polimeraze I. To nakazuje na dejstvo, da v odsotnosti nenaravnih nukleotidov pride do izgube UBP s pomočjo replikacijsko posredovanega napačnega parjenja in ne s pomočjo delovanja popravljalnih mehanizmov (Malyshev et al., 2014)⁠. 

==Zaključek==
Raziskovalna ekipa je tako dokazala, da je mogoče modificirati organizem tako, da s pomočjo transporterja PtNTT2 vnaša nenaravne nukleotidne trifosfate, ki so nato s pomočjo endogenih polimeraz uporabljeni pri replikaciji DNA, ki vsebuje UBP. Taka DNA je stabilna tako med logaritemsko fazo kot med stacionarno fazo, kljub prisotnosti vseh celičnih popravljalnih mehanizmov. Rast bakterij je v primeru izražanja PtNTT2 rahlo upočasnjena, vendar niti prisotnost nenaravnih trifosfatov niti podvojevanje UBP rasti ne upočasnita dalje. Rezultat je bakterija, ki relativno stabilno hrani DNA s tremi različnimi baznimi pari.

Pri eksperimentu je šlo predvsem za dokaz koncepta (angl. ''proof of concept''), ki pa na trenutni stopnji razvoja še nima uporabne vrednosti. Kljub temu, da je predstavljeni članek iz leta 2014, do danes ni bilo narejenega pričakovanega napredka. Ista skupina je leta 2017 objavila nov članek, v katerem so naslovili nekatere probleme iz originalnega eksperimenta. Gen za transporter so kodonsko optimizirali in ga vnesli v bakterijski genom ter ga dali pod konstitutivni promotor. Uvedli so tudi mehanizem za razgradnjo plazmidov, kjer je prišlo do izgube UBP, raziskali pa so tudi vpliv “konteksta” na ohranjanje UBP v DNA. Z vsemi optimizacijami so uspeli doseči, da je celica tudi po 100 delitvah zadržala UBP brez zaznane izgube (Zhang et al., 2017)⁠. 
Takšna celica, ki lahko hrani večjo gostoto informacij zelo stabilno tudi za daljša obdobja, predstavlja primerno platformo za razvoj organizmov s popolnoma ortogonalnimi omrežji in lastnostmi, ki niso prisotne nikjer v naravi. 

==Viri==
Dhami, K., Malyshev, D. A., Ordoukhanian, P., Kubelka, T., Hocek, M., & Romesberg, F. E. (2014). Systematic exploration of a class of hydrophobic unnatural base pairs yields multiple new candidates for the expansion of the genetic alphabet. Nucleic Acids Research, 42(16), 10235–10244. https://doi.org/10.1093/nar/gku715
Lavergne, T., Malyshev, D. A., & Romesberg, F. E. (2012). Major groove substituents and polymerase recognition of a class of predominantly  hydrophobic unnatural base pairs. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany), 18(4), 1231–1239. https://doi.org/10.1002/chem.201102066
Malyshev, D. A., Dhami, K., Lavergne, T., Chen, T., Dai, N., Foster, J. M., … Romesberg, F. E. (2014). A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet. Nature, 509(7500), 385–388. https://doi.org/10.1038/nature13314
Zhang, Y., Lamb, B. M., Feldman, A. W., Zhou, A. X., Lavergne, T., Li, L., & Romesberg, F. E. (2017). A semisynthetic organism engineered for the stable expansion of the genetic alphabet. Proceedings of the National Academy of Sciences, 114(6), 1317–1322. https://doi.org/10.1073/pnas.1616443114